Name: de novo generation of somatic stem cells by yap/taz
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

Wir danken für das Geschenk von TetO-YAPS127A MäusenF. Camargo; R26-rtTAM2 Mäuse (Lager #006965) wurden von The Jackson Laboratory gekauft. Wir danken Chiara Frasson und Giuseppe Basso für Hilfe mit FACS-Verfahren. Diese Arbeit wird unterstützt durch AIRC spezielle Programm Molekulare Clinical Oncology '' 5 Promille '' und ein AIRC PI-Grant, S.P und Epigenetik Vorzeigeprojekt CNR-Miur gewährt S.P. Dieses Projekt wird finanziell vom European Research Council (ERC) unter der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm (Finanzhilfevereinbarung DENOVOSTEM Nr. 670126).

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	<li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage.">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration.">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281 (2014).</li><li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation.">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li><li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program.">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li><li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis.">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li><li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration.">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+of+mutant+KRAS,+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).</li><li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+at+the+Roots+of+Cancer.">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li><li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response.">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates.">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li><li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia.">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li><li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage.">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li><li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration.">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li><li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration.">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration.">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li><li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease.">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier präsentieren wir Protokolle, um ex-Vivo unheilbar differenzierten Epithelzellen der verschiedenen Geweben in ihre entsprechenden gewebespezifischen Vorläuferzellen (oder ySCs) umprogrammieren von Transienten Expression von YAP, wie bereits berichtet1. Wir haben zwei Verfahren detailliert: eine Reprogrammierung von FACS gereinigt durch Lentivirale Vektoren und eine zweite, die virale Infektion vermeidet und nutzt die Vorteile der transgenen YAP Ausdruck ermöglicht. Jedes Protokoll stellt eine effiziente Strategie zu isolieren und Kultur primären differenzierte Zellen und eine Strategie zur exogenen Kraft YAP Genexpression in differenzierten Zellen generieren de Novo gewebespezifischen erweiterbar gewebestammzellen (siehe Regelungen in Abbildungen 1A und 2A).
Wir bewiesen, dass die hier vorgestellten effektiv isoliert-Strategien eine reine Bevölkerung von differenzierten Zellen isolieren, wie durch die Tatsache bewiesen, dass wir nie irgendwelche Auswuchs von negativen Kontrollproben (Abbildungen 1 und 2 C) erkannt.
Die Lentivirale Vektoren verwendet in dieser Studie für die Reprogrammierung von primären Mamma LD sind Doxycyclin induzierbaren, bietet die Möglichkeit, eine strenge Kontrolle des Transgens Ausdrucks; Dadurch schalten und aus exogenen YAP Ausdruck zu werden. Besondere Aufmerksamkeit sollte in den Verzicht auf eine übermäßige virale Titer platziert werden, wie dies im Hinblick auf die Umprogrammierung Effizienz nachteilig sein kann. Im Falle der primären acinar Zellen wechselten wir in ein vollständig transgenen Ansatz zu einer YAP-abhängige Neuprogrammierung mit minimalen Manipulationen. Diese letztere Strategie eignet sich auch besonders für primäre pankreatischen Azini, wie isolierte acinar Cluster Lentivirale Infektion kaum zugänglich und sehr zerbrechlich sind. Die transgenen Strategie bietet den gleichen Vorteil von Doxycyclin-abhängige Lentivirale Vektoren für die strenge Kontrolle der Genexpression. Darüber hinaus trägt die transgenen Strategie ausgenutzt mit primären pankreatischen Azini den Vorteil einer wesentlich höheren Neuprogrammierung Wirkungsgrad im Vergleich zu der viral induzierten Reprogrammierung von Mamma LD. Über die verschiedenen intrinsischer Plastizität Zellen aus verschiedenen Geweben zugeordnet kann die höhere Rate der pankreatischen Neuprogrammierung von der höheren Effizienz der Ausdruck verbunden, einheitliche und autonome YAP Ausdruck in allen abgeleitet werden explantierten Zellen. Insbesondere haben wir gezeigt, dass exogene YAP nach der Generierung von ySCs (yMaSC-Kolonien und yDucts), entfällt ohne ihre Selbsterneuerung Kapazität. Und zwar deshalb, weil ySCs endogenen YAP/TAZ zu reaktivieren und nutzen sie für Selbsterneuerung1exogene YAP ausgeschaltet ist.
Wir validiert die Vorstellung, die ySCs in der Tat von differenzierten Zellen entstehen durch die Kontrolle der Zelle der Ursprung unserer Neuprogrammierung Experimente durch genetische Abstammung-Ablaufverfolgung Validierungen1.
Umfassende Charakterisierungvon ySCs zeigt, dass YAP-induzierte Umprogrammierung normale somatische SCs1 als ich erzeugt) auf der transkriptomischen Ebene anzeigen ySCs massive Überschneidungen mit native SCs; (II) ySCs Anzeige Differenzierungspotenzial und erzeugen eine multilineage Nachkommen immer beschränkt auf die Identität des ihr Gewebe des Ursprungs; (III) ySCs werden nicht verändert und nicht tumorigenic wann verpflanzt in Vivo.
Hier beschreiben wir auch Verfahren zu erhalten und zu erweitern in der Kultur yMaSCs und yDucts als Organellen in 100 % Basalmembran Matrix Hydrogele eingebettet. Diese Bedingungen ermöglichen für die Selbstorganisation des ySCs in dreidimensionale Organellen, die Stemness Eigenschaften Kultur langfristig zu gewährleisten, ermöglichen, diese zu erweitern Bevölkerung nach Belieben für nachgelagerte Analysen und Anwendungen stammen. Aus unbekannten Gründen wir Fehler beim Abrufen yMaSC Organellen indem man infiziert LD Zellen direkt in organoide Kulturbedingungen 7 Tage nach der Behandlung Doxycyclin in Kunststoff Gewebekultur Platte; in anderen Worten, ist der mittlere Wachstum Schritt in Mamma Kolonie Bedingungen unerlässlich. In unseren Händen erfordern auch native MaSCs Mamma Kolonie Bedingungen vor passagierung in organoide Kultur. Darüber hinaus wird die effizienteste organoide Auswuchs erreicht, wenn wir vermeiden, liegt die primäre Kolonien in einzelnen Zellen, sondern die intakten Kolonien in organoide Kulturbedingungen übertragen.
Organoide Kulturbedingungen tragen auch den Vorteil bietet die Möglichkeit, ySCs, Tiefgefrieren, vorausgesetzt, dass die Organellen aus ihrer Matrizen, Vermeidung von Zelle Dissoziation vor der Kryokonservierung in Stickstoff Bad zurückgewonnen werden.
Die YAP Umprogrammierung Verfahren vorgestellt kann verschiedene differenzierte Zelltypen abgeleitet aus verschiedenen Erwachsenen Geweben in ihren entsprechenden gewebespezifische Stammzellen (wir haben es mit Mamma, Pankreas und neuronalen Zellen getestet) umwandeln1. Im Unterschied zu iPSCs oder andere Neuprogrammierung Bemühungen können YAP/induzierte SCs die Erinnerungen an ihr Gewebe Herkunft pflegen. Der Hinweis de-Differenzierung der somatischen Zellen in Zellen mit Stiel-ähnliche Eigenschaften ausgestattet ist die einzige Form der Zelle Schicksal Plastizität und Umprogrammierung in vivo beobachtet, zum Beispiel nach Gewebeschäden und zur Unterstützung der Wundheilung5,17 , 18 , 19 , 20. es ist bemerkenswert, dass YAP und TAZ für normale Homöostase weitgehend entbehrlich sind aber entscheidend für die Reparatur von Gewebe in mehreren Geweben11,21. Konsequent mit einer physiologischen Funktion der Neuprogrammierung Schritte hier beschrieben, haben YAP/TAZ kürzlich gezeigt, dass im Darm Regeneration in Mausmodellen der Colitis ulcerosa Patienten geforderten verursacht eine Umwandlung von Erwachsenen Darmzellen in eine Reparatur von Epithel, die Funktionen des fetalen Darm19anzeigt. YAP Umprogrammierung erweitert somit die aktuellen induzierte Zelle Plastizität Strategien indem Sie ein Mittel zu generieren somatische Stammzellen, ein Staat, der bislang streitig gemacht, in Vitrozu erfassen. Dieser Ansatz, könnte wenn auch auf Menschen-abgeleitete Zellen erweitert haben breite Relevanz aus regenerativen Medizin Anwendungen zur Erforschung des somatischen Stemness Staates und ergeben sich für die Erweiterung der somatischen Zellen in Vitro.

Gewebe-spezifische somatische Stammzellen (SCs) sind entscheidend für Gewebe Erneuerung und Reparatur nach Verletzung. Die Möglichkeit, leicht isolieren und unbegrenzt erweitern Ex Vivo somatische SCs stellt ein schwerwiegendes Problem für potenzielle regenerative Therapien sowie für SC-Anwendungen in der Grundlagenforschung und Krankheit Modellierung. Fortschritte in dieser Richtung wurde jedoch durch die Schwierigkeit der Erfassung des SC-Zustand der verschiedenen epithelialen Organe in Vitrobegrenzt. In der Tat in mehreren adulten Geweben resident SCs können nicht vorhanden oder nicht verfügbar sein, oder ihre Anzahl und regenerative Potenzial können durch Alterung oder Krankheit Bedingungen erodiert. Im Jahr 2016 haben wir begonnen, diese Lücke durch die Berichterstattung dieser Ausdruck einer einzigen transcriptional Coactivator YAP (ja-assoziierten Protein) oder die eng verwandten Protein TAZ (transcriptional Aktivator mit einem PDZ-Motiv), unheilbar differenzierte Zellen effizient schafft funktionale, erweiterbar, nicht tumorigenic, autologe Zell-Populationen, die operativ und Molekular von ihren entsprechenden gewebespezifischen SCs1zu unterscheiden sind. Ein Puls von getragen YAP oder TAZ Aktivität für einige Tage ist ausreichend, um das Aussehen der selbst erneuern somatische SCs zu induzieren. Dies ist ein stabiler Zustand, der nicht mehr kontinuierliche Transgene Ausdruck abhängig ist, wie es durch Zelle Generationen ohne weitere Ausdruck ektopische YAP/TAZ1übertragen werden kann. Das Protokoll hier vorgestellten Einzelheiten des Verfahrens Erzeugung von de Novo epithelialen Stammzellen/Vorläuferzellen der Brustdrüse und der Bauchspeicheldrüse zur, differenzierte Zellen dieser Gewebe ab. Diese Prozedur füllt eine Black Box in der aktuellen Neuprogrammierung/Transdifferenzierung Arena. Große Anstrengungen in diese Richtungen haben in der Tat bisher zentriert auf Zelle Übergang zu einem induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) Zustand, gefolgt von der Umwandlung von diesen embryonalen und pluripotenten SCs in differenzierter Zellen. Allerdings sind iPSCs tumorigenic einmal in adulten Geweben, heben die Notwendigkeit der Entwicklung von Protokollen für ihre vollständige und effiziente Differenzierung2eingeführt. Jedoch kommt diese Differenzierung Schritt, auch wenn möglich, zum Preis von langfristigen Erweiterbarkeit, Selbstorganisation und Orgel Wiederbesiedlung Potenziale. Das sind wesentliche Attribute für Organregeneration, die in der Tat nur der endogenen gewebespezifischen SCs und der derzeit beschriebenen YAP-induzierte SCs (ySCs) typisch sind. In ähnlicher Weise differenzierte direkte Transdifferenzierung von einem Zelltyp ineinander mit Cocktails aus verschiedenen Transkription Faktoren auch erzeugen Zellen, die wesentliche proliferative und Stemness mögliche3fehlt.
Das hier beschriebene Verfahren nutzt auch die kürzlich eingeführte organoide Technologie, durch die endogene SCs erweiterbar und ex Vivo4differenziert. YAP-induzierte SCs können organoide Formen SCs sogar im Versuchsbedingungen, biologische oder Krankheit generieren in denen endogenen SCs nicht vorhanden sind. Wir möchten beachten, dass sich die Differenz mit anderen Neuprogrammierung Verfahren, die Art der Zelle Plastizität durch YAP vermittelt die einzige Form der Rückfall in eine SC-Status wie entsprechen kann, die in lebendes Gewebe auftritt. Rückgewinnung von SC-ähnlichen Merkmalen wurde Gewebereparatur oder Onkogene Aktivierung5zugeordnet. Obwohl entbehrlich für die Homöostase von mehreren adulten Geweben sind YAP und/oder TAZ absolut notwendig für Regeneration, Tumorwachstum und Erweiterung der somatischen SCs in Vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">10 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:123px;">Rays</td>
			<td style="width:112px;">10LC</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm&#160; cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">15 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430052</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">24-well ultra low attachment plates</td>
			<td style="width:123px;">Costar</td>
			<td style="width:112px;">3473</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">40 mm cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:112px;">352340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">48-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353078</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">50 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430290</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">6-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353046</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">12634028</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPE</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Collagenase, type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018029</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">1705-041</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:123px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:112px;">0503</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">11320033</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">DMSO</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">D2650</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DnaseI</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:112px;">11284932001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">E5134</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FACS tubes (with strainer caps)</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:112px;">352235</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">118208</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#19780&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-EGFP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84041</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-MCS</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84008</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-wtYAP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84009</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:481px;">FUW-tetO-YAPS94A</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84010</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">35050061</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">24020117</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">H3149&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15630-056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human R-Spondin1 (His Tag)</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>11083-H08H-5</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS-X</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab7800&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-8 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab14053&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">&#160;25030081</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">51-9003632</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#174; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0402</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &#248; 94)</td>
			<td style="width:123px;">ROLL</td>
			<td style="width:112px;">18248</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 10x</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM4004XL</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Hamster Anti-Mouse CD61</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">553347</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">551129</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">102222</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I (coating)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">122-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I for 3D culture</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine FGF basic (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td style="width:112px;">450-33</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris BASE&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0,05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waymouth medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31220023</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

Hier präsentieren wir Protokolle, um primäre differenzierte Zellen und drehen Sie sie in Stamm/Vorläuferzellen (SCs) derselben Linie durch transiente Expression des Transkriptionsfaktors YAP zu isolieren. Mit dieser Methode werden luminalen differenzierte (LD) Zellen der Brustdrüse Maus in Zellen umgewandelt, die molekulare und funktionelle Eigenschaften von Mamma SCs. YAP auch Kurven voll differenzierte exokrinen Pankreaszellen in Pankreas Rohr-ähnliche aufweisen Stammväter. In ähnlicher Weise an endogenen, natürlichen SCs, YAP-induzierten Stammzellen-ähnliche Zellen ("ySCs") schließlich als organoide Kulturen langfristig in-vitro- ohne weitere Notwendigkeit ektopische YAP/taz, erweiterbar wie ySCs mit einem Erbbaurecht selbst erneuernde SC-ähnlichen Zustand ausgestattet sind.
Die Neuprogrammierung Verfahren hier vorgestellten bietet die Möglichkeit zu generieren und in-vitro- Vorläuferzellen der verschiedenen Gewebe Quellen ausgehend von differenzierten Zellen zu erweitern. Die einfache Erweiterung der somatischen Zellen ex Vivo hat Folgen für regenerative Medizin, Verständnis der Mechanismen der Tumorentstehung und im Allgemeinen für Zell- und Entwicklungsbiologie Studien.

Generation von yMaSCs Ein Überblick über die experimentelle Strategie zur primäre Mamma LD-Zellen durch transiente Expression von YAP zu programmieren ist in Figur 1Apräsentiert. Primäre Mamma LD Epithelzellen sind durch Leuchtstofflampen-aktivierte Zelle Sortieren13gereinigt. Abbildung 1 b stellt eine typische Sortierung Prozedur zu drei unterschiedliche Subpopulationen: Basalzellen (EpCAMniedrigeCD49fhoheCD61–), luminalen Vorläuferzellen (LP) Zellen (EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61+ ) und LD-Zellen (EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61–). Vorsichtig sein, dass von den drei Subpopulationen gating ist unerlässlich um eine reine Herstellung von LD-Zellen zu isolieren, die vollständig unterscheiden sich und völlig Wachstum bei ausgesät in Brustdrüse koloniebildenden Bedingungen (siehe Abbildung 1, Links Panel) verhaftet. Umgekehrt, starten, wenn induziert, exogene YAP auszudrücken, LD Zellen vermehren um leicht erkennbar dichten epithelialen Kolonien in 5 % Basalmembran Matrix Suspensionskulturen (Abbildung 1) bilden. Die Effizienz der Neuprogrammierung, bezeugt rund 3 % für ein typisches experiment, kann durch zählen der Anzahl der Kolonien über die Anzahl der Einzelzellen, die ursprünglich in Basalmembran Matrix Suspensionskulturen (Abbildung 1) ausgesät gewertet. Umprogrammierten luminalen Zellen (yMaSCs) kann dann Übergang in 100 % Basalmembran Matrix organoide Kulturbedingungen (siehe Schema in Abbildung 1A), Self-organizing in komplexe organoide-ähnliche Strukturen, die um mehrere Lumen zu entwickeln und bemerkenswerte Selbsterneuerung Fähigkeit auch in Abwesenheit von Doxycyclin (d.h. in Abwesenheit von transgenen YAP Ausdruck) angezeigt (Abbildung 1E). Histologisch, yMaSC-abgeleitete Organellen zeigen eine basale Schicht (K14 positiv), mit Blick auf die Basalmembran Matrix rekonstituiert ECM und einer luminalen Schicht (K8 positiv), mit Blick auf die Lumen-Vertiefungen innerhalb der organoide (Abb. 1F). Diese Architektur ist zu unterscheiden von der Organellen durch native MaSCs (Abb. 1F) gebildet.
Generation von yDucts Ein Überblick über die experimentelle Strategie zur primären pankreatischen Azini durch transiente Expression von YAP zu programmieren ist in Abbildung 2Apräsentiert. Gesamte acinar Cluster sind von den Großteil der Bauchspeicheldrüsen-Gewebe durch eine Kombination aus milden Dissoziation und Größe Ausgrenzung durch Filtrierung isoliert. Eine typische Zubereitung wird in Abbildung 2 bdargestellt. Nach Isolierung sollte die acinar zellcluster als Suspension der exokrinen acinar Einheiten der homogene Größe ohne Kontamination durch endokrine Langerhans Inseln oder Fragmente der pankreatischen duktalen Baum und minimale Dissoziation Einzelzellen angezeigt werden. Kontamination durch endokrine Inselchen oder duktale Fragmente ist ein Hinweis auf mangelhafte selektive Filterung (Schritt 2.1.10), möglicherweise durch raue Handhabung; unerwünschte Dissoziation von acinar Clustern einzelner Zellen möglicherweise aufgrund übermäßigen Kollagenase-Behandlung oder ungepufferter Aktivität der proteolytischen Enzymen durch das Gewebe, die durch zusätzliche SBTI Behandlung gebremst werden kann.
Ein typisches acinar Neuprogrammierung Experiment ist in Abbildung 2dargestellt. innerhalb von 5-7 Tagen Kultur in 3D Kollagen-ich Sitz Hydrogel in Anwesenheit von Doxycyclin, Pankreas Azini abgeleitet R26-rtTAM2/TetO-YAPS127A Mäuse leicht biegen Sie in Rohr-ähnliche Cluster (, den wir yDuctsgenannt), bestehend aus einer dünnen Monolage von epithelialen Zellen, die um eine expandierende zentralen Hohlraum zu vermehren. Die Neuprogrammierung Effizienz, die rund 70 % für ein typisches Experiment ist, kann leicht gemessen werden, erzielte die Anzahl der Rohr-ähnliche Cluster über die Gesamtzahl der kernigen Azini (Abb. 2D). Die Negativkontrolle Zellen, d. h. R26-rtTAM2 / + oder R26-rtTAM2/TetO-YAPS127A Zellen Links ohne Doxycyclin, unveränderlich bleiben als Post-mitotische acinar Cluster in diesen Kulturbedingungen, wie bereits berichtet1 ,14,15. Umprogrammierten yDucts kann dann auf der Ebene der einzelnen Zelle in Matrigel-basierte organoide Kultur Bedingungen16 passagiert werden (siehe Schema in Abbildung 2A), bemerkenswerte Selbsterneuerung Fähigkeit auch in Abwesenheit von Doxycyclin (d.h. anzeigen in Abwesenheit von transgenen YAP Ausdruck) (Abb. 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Abbildung 1: Isolation von primären Mamma LD Zellen und Induktion von Mamma Stammzellen. (A) schematische Darstellung der Versuchsanordnung angenommen primäre Mamma LD Zellen umzuprogrammieren. (B) Vertreter FACS-Darstellungen zur Veranschaulichung einer typischen Sortierung Prozedur LD Zellen zu reinigen. (i) dissoziierte Zellen werden nach vorwärts und seitliche Streuung für lebende Zellen (P1; blau) angespritzt. (II) Bevölkerung P1 ist dann weiter nach Lin Profil eingezäunt: Subpopulation von Lineage-negativen Zellen (P2; grau) ausgewählt ist, ausgenommen Linie-positiven hämatopoetische Zellen; (III) Bevölkerung P2 wird dann in einer EpCAMhoch (P3; gelb + grün) und eineniedrige (P6; rot) Subpopulationen EpCAM getrennt; (IV) P3 und P6 werden dann weitere angespritzt entsprechend ihrer CD61/CD49f Profil in drei Untergruppen: EpCAMniedrigeCD49fhoheCD61– Basalzellen (P7; rot), EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61+ LP Zellen (P8; gelb) und EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61– LD Zellen (P9; grün). (C) Bilder sind Beispiele für die Fähigkeit der LD Zellen, infiziert mit dem angegebenen Konstrukten, Mamma Kolonien bilden 15 Tage nach der Aussaat in Mamma Kolonie Medium. Nur YAP exprimierenden Zellen wiederum in koloniebildenden Zellen, während negative Kontrolle (EGFP-infizierten) Zellen bleiben als Einzelzellen Wachstum verhaftet. Maßstabsleiste = 50 μm. (D) Quantifizierung der koloniebildenden Fähigkeit der angegebenen Zellen, wie in (C). Daten sind als Mittelwert + s.d. präsentiert und sind Vertreter von fünf unabhängigen Experimenten, jeweils mit sechs technischen repliziert. (E) repräsentatives Bild von YAP umprogrammiert Mamma Stammzell-ähnliche Zellen (yMaSCs) nach 12 Tagen in organoide Kulturbedingungen in frischen dreidimensionale 100 % Basalmembran Matrix Hydrogel in Ermangelung von Doxycyclin. Maßstabsleiste = 100 μm. (F) repräsentative Immunfluoreszenz Bilder für die basalen Marker K14 (grün) und der luminalen Marker K8 (rot) von Organellen abgeleitet aus den angegebenen Zellen nach 12 Tagen in organoide Kulturbedingungen. Maßstabsleiste = 10 μm. Diese Zahl wird von Panciera Et Al., 20161wiedergegeben. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Abbildung 2 : Isolierung des primären pankreatischen acinar Zellen und Induktion von Pankreas Vorfahren. (A) schematische Darstellung der Versuchsanordnung reprogram primäre acinar Zellen der Bauchspeicheldrüse exokrine angenommen. (B) repräsentatives Bild der primären pankreatischen Azini kurz nach der Isolierung-Verfahren (Schritt 2.1.14). Die acinar Vorbereitung sollte als eine homogene Suspension acinar Cluster mit minimalen Präsenz einzelner Zellen erscheinen. Maßstabsleiste = 400 μm. (C) repräsentative Bilder von primären pankreatischen Azini abgeleitet R26-rtTAM2 (oberen Platten)oder R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A (untere Verkleidungen) Mäuse und kultiviert in 3-d-Kollagen ich-basierte Hydrogel für 5 Tage mit oder ohne Doxycyclin (Doxy), wie angegeben. Nur konvertieren primäre Azini YAP exprimierenden Zellen wachsen als zystenartigen organoide nach Doxycyclin Zugabe. Skalieren von Balken = 70 μm. (D) Quantifizierung der Fähigkeit der Bauchspeicheldrüse Azini duktale Organellen bei transgenen Überexpression von YAP wie in (C) bilden. Daten sind als Mittelwert + s.d. präsentiert und sind Vertreter von fünf unabhängigen Experimenten mit vier technischen repliziert. (E) repräsentatives Bild von YAP neuprogrammiert duktale-ähnliche Zellen (yDucts) nach drei Passagen in frischen dreidimensionale 100 % Basalmembran Matrix Hydrogel in Ermangelung von Doxycyclin. Maßstabsleiste = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolation von primären Mamma Zellen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 + chelatisierenden Lösung</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02 % w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagen ich Beschichtung Lösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Essigsäure 0.02N, pH-Wert 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ratte Tail Kollagen (Beschichtung)</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase Lösung</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dissoziation Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase-Stammlösung</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stammlösung Kollagenase ich</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hämolytische Lösung</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl-Lösung</td>
			<td>1 Teile</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20,6 g/L</td>
			<td>9 Teile</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH-Wert auf 7,2 einstellen</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase-Stammlösung</td>
			<td>0,2 µm-Filter, bei 4 ° C lagern</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase aus bovine Hoden (Pulver)</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumphosphat-Puffer 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl-Lösung</td>
			<td>Bei T. Amb lagern.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anpassen der pH-Wert auf 7,65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sortierung der Lösung</td>
			<td>0,2 µm-Filter, bei 4 ° C lagern</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Waschen Sie Medium #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waschen Sie Medium #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mamma 2D Kulturmedium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Induktion und Passaging von yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mamma Kolonie Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (fügen Sie unmittelbar vor der Aussaat)</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mamma organoide Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Erweiterte DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>menschlichen Birne</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Generation von yMaSCs. Zusammensetzung aller verschiedenen Nährmedien und Lösungen für die Isolation von primären Mamma LD Zellen und Induktion von yMaSCs (Abschnitt 1)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolierung der primären pankreatischen Azini</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar Kulturmedium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexamethason</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ABt</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar Wash Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar Rettungsmediums</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar Kulturmedium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ABt</td>
			<td>30 %</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagenase ich Lösung A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar Wash Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stammlösung Kollagenase ich</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stammlösung Kollagenase ich</td>
			<td>Shop bei-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase, Typ ich (Pulver)</td>
			<td>6.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Der pankreatischen Organellen passagierung</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagenase ich Lösung B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 X</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stammlösung Kollagenase ich</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pankreas organoide Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Erweiterte DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>menschliche FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>menschlichen Birne</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcystein</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Generation von yDucts. Zusammensetzung aller verschiedenen Nährmedien und Lösungsvorschläge für die Isolierung von primären acinar Zellen und Induktion und passagierung der yDucts (Abschnitt 2).

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De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Verfügbarkeit von somatischen SCs ist entscheidend für die regenerative Medizin Krankheit Modellierung und Einblick in SC Eigenschaften. Hier präsentieren wir experimentelle Strategien reprogram, in Vitro unterscheiden sich adulte Zellen in ihre entsprechenden erweiterbar gewebespezifische Stammzellen/Progenitor-Zellen durch die transiente Expression die transkriptionelle Coaktivator YAP.

De Novo Generation von somatischen Stammzellen von YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Generation of Human CD40-activated B cells

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Forschung

Biologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Analyse von pluripotenten Stammzellen mit Kryoschnitte von Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench für<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Aufbau von Biomolekülen

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Erzeugung transgener<em&gt; Hydra</em&gt; Durch Mikroinjektion Embryo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...