Name: de novo generation of somatic stem cells by yap/taz
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

אנו מודים קמרגו פ על המתנה של עכברים tetO-הפהS127A ; R26-rtTAM2 עכברים (מניות #006965) נרכשו מן המעבדה ג'קסון. אנו מודים Frasson קיארה ו ג'וזפה באסו לעזרה עם FACS נהלים. עבודה זו נתמכת על ידי למקורות מיוחד תוכנית מולקולרית לאונקולוגיה קלינית ' 5 לכל מיל"ומענקים למקורות PI-גרנט כדי פ מ, ועל ידי פרויקט הדגל אפיגנטיקה CNR-Miur ל פ מ הפרויקט קיבל מימון מ אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת המחקר של האיחוד האירופי אופק 2020 ולהעניק והחדשנות (הסכם DENOVOSTEM מס 670126).

<ol>
	<li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage.">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration.">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281 (2014).</li><li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation.">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li><li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program.">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li><li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis.">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li><li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration.">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+of+mutant+KRAS,+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).</li><li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+at+the+Roots+of+Cancer.">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li><li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response.">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates.">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li><li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia.">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li><li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage.">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li><li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration.">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li><li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration.">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration.">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li><li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease.">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לתכנת שמחוץ סופני הבדיל לתאי האפיתל של רקמות שונות לתוך רקמות ספציפיות המתאימות ובתאים שלהם (או ySCs) על-ידי ביטוי ארעית של הפה, כפי שדווח בעבר1. שתוארו שני ההליכים: אחד המאפשר תכנות מחדש של תאים FACS מטוהר באמצעות וקטורים lentiviral, עוד אחד מונע זיהום נגיפי, מנצל הטרנסגניים ביטוי הפה. כל פרוטוקול מציג אסטרטגיית יעיל כדי לבודד, תאים ראשי תרבות ואסטרטגיה לכפות אקסוגני לחרטט ביטוי גנים בתאים הבדיל, יצירת דה נובו סומאטית רקמות ספציפיות ניתן להרחבה תאי גזע (ראה ערכות ב דמויות 1A ו- 2A).
אנחנו הפגינו האסטרטגיות בידוד כאן הציג ביעילות לבודד את אוכלוסיית תאים, כפי שמתואר על ידי העובדה מעולם לא גילינו שום תוצר מדגימות שליטה שלילי (דמויות 1C ו- 2 C).
הווקטורים lentiviral המשמש במחקר זה התכנות של ראשי תאים LD החלב הן דוקסיציקלין inducible, מציעים את האפשרות של שליטה חזקה מאוד של הביטוי transgene; אפשרות זו מאפשרת להפעיל, את הפה אקסוגני יהיה ביטוי. תשומת לב מיוחדת יוצבו להימנע השימוש כייל נוגדנים ויראלי מופרז, משום שזו יכולה להיות מזיקה במונחים של התכנות יעילות. במקרה של תאים acinar הראשית, החלפנו לגישה מלאה הטרנסגניים להשיג תלויי-הפה התכנות עם מניפולציות מינימלי. האסטרטגיה השנייה הוא גם מתאים acini הלבלב העיקרית, כמו אשכולות acinar מבודדים הם בקושי נוטה? זיהום lentiviral והוא עדין מאוד. האסטרטגיה הטרנסגניים המועסקים מציעה את אותו היתרון של וקטורים lentiviral תלויי-דוקסיציקלין שליטה הדוקה של ביטוי גנים. יתר על כן, האסטרטגיה הטרנסגניים לנצל עם ראשי acini הלבלב נושאת על היתרון הנוסף של הרבה יותר גבוה התיכנות יעילות לעומת ויראלי-induced התיכנות של תאים LD החלב. מעבר פלסטיות פנימיים שונים הקשורים לתאים שמקורם ברקמות שונות, שיעור גבוה יותר של התכנות הלבלב עלול להיגזר ממנה יעילות גבוהה יותר של ביטוי הקשורים לביטוי הפה אחיד ובלתי אוטונומית בכל תאים explanted. ראוי לציין, הראו כי הפה אקסוגני אינו נדרש אחרי דור של ySCs (מושבות yMaSC ו- yDucts), מבלי להשפיע על יכולת התחדשות עצמית שלהם. זה בגלל ySCs מחדש הפה אנדוגני/טאז, להשתמש בהם עבור התחדשות עצמית כאשר הפה אקסוגניים. מושבתת1.
אנחנו לאמת התפישה ySCs אכן מגיחים תאים על-ידי שליטה התא ממוצא שלנו הניסויים התיכנות באמצעות שושלת היוחסין-מעקב גנטי אימותים1.
אפיון מקיףשל ySCs מראה כי הפה-induced התכנות יוצר נורמלי סומאטית SCs1 כמוני) ברמת transcriptomic, ySCs להציג חופף מסיבית עם SCs מקורי; ii) ySCs מציגים בידול פוטנציאליים, ניתן להפיק בדיוק הבנתי multilineage תמיד מוגבלת בזהות שלהם רקמת המוצא; iii) ySCs שאינו משתנה, כאשר אי-tumorigenic מושתלים ויוו.
כאן נתאר גם הליכים לתחזק ולהרחיב בתרבות הן yMaSCs והן yDucts כמו organoids נעוץ קרום המרתף 100% מטריקס hydrogels. תנאים אלה מאפשרים ארגון עצמי של ySCs לתוך organoids תלת מימדי להבטיח קיומם של מאפיינים stemness לטווח ארוך בתרבות, שמאפשר להרחיב את אלה נובעות אוכלוסיות כרצונו ניתוחים במורד הזרם ויישומים. מסיבות לא ידועות, אנחנו לא ניתן היה לקבל yMaSC organoids על-ידי הצבת נגוע LD תאים ישירות בתנאים תרבות תא צורב 7 ימים לאחר הטיפול דוקסיציקלין בצלחת פלסטיק תרביות רקמה; במילים אחרות, השלב ביניים גדילה בתנאים המושבה החלב חיוני. בידיים שלנו, אפילו מקורי MaSCs דורשים תנאי המושבה החלב לפני passaging בתרבות תא צורב. יתר על כן, תוצר היעילה תא צורב מתקבל כאשר אנחנו להימנע בריא המושבות הראשי לתוך תאים בודדים, אבל מעדיף להעביר את המושבות ללא פגע לתוך תא צורב תרבות תנאים.
תא צורב תרבות תנאים גם לשאת את היתרון של נותן את האפשרות cryopreserve ySCs, ובלבד organoids הם התאוששו מטריצות שלהם, הימנעות תא דיסוציאציה לפני הקפאה קריוגנית באמבטיה חנקן.
הפה התכנות הליך שהוצגו ניתן להמיר סוגי תאים הבדיל ברורים שמקורם ברקמות למבוגרים שונות לתוך המתאימים רקמות ספציפיות תאי הגזע שלהם (בדקנו אותו באמצעות תאים החלב, הלבלב ו עצביים)1. ההבדל iPSCs או אחרים מאמצים התיכנות, הפה/המושרה SCs יכול לשמור על הזכרונות שלהם רקמת המוצא. ראוי לציין, דה-התמיינות של תאים סומטיים לתוך תאים ניחן בתכונות כמו גזע היא הצורה היחידה של פלסטיות גורל התא והנצפית התכנות ויוו, לדוגמה לאחר נזק לרקמות ולתמוך5,17 ריפוי הפצע , 18 , 19 , 20. זה ראוי לציין כי הפה ו TAZ הם במידה רבה לוותר על הומאוסטזיס נורמלי אבל קריטי לתיקון רקמות רקמות מספר11,21. בעקביות עם תפקוד פיזיולוגי של התיכנות השלבים המתוארים כאן, הפה/טאז לאחרונה הוכחו שתידרש התחדשות מעיים במודלים של העכבר של חולי קוליטיס באמצעות גרימת המרה של התאים מעיים למבוגרים אפיתל תיקון מציגה תכונות של בטן העובר19. הפה התכנות ובכך מרחיב את האסטרטגיות פלסטיות המושרה תא הנוכחי על-ידי מתן אמצעים כדי להפיק תאי גזע הסומטית, מדינה כה מאתגרת כדי ללכוד חוץ גופית בתוך. גישה זו, אם מורחב גם לתאי האדם, נגזר, שיש לה רלוונטיות רחבה מיישומים רפואה רגנרטיבית לחדר העבודה של המדינה stemness הסומטית, להרחבת סומאטית גזע תאים במבחנה.

תאי גזע סומאטית רקמות ספציפיות (SCs) הם קריטיים עבור חידוש רקמות ותיקון לאחר פציעה. האפשרות בקלות לבודד ולהרחיב unlimitedly vivo לשעבר סומאטית SCs מייצג בעיה קריטית עבור טיפולים regenerative פוטנציאלי, כמו גם עבור יישומים SC מחקר בסיסי, מידול המחלה. התקדמות בכיוון זה, עם זאת, יש כבר מוגבל על ידי הקושי של לכידת מדינת SC אפיתל איברים שונים בתוך חוץ גופית. ואכן, מספר רקמות בוגרות SCs תושב אינם קיימים, או לא יהיו זמינים או מספר ופוטנציאל הרגנרציה שלהם עלול להתערער עקב תנאי מזדקן או מחלה. בשנת 2016, התחלנו למלא את החלל הזה על ידי דיווח את הביטוי הזה של coactivator תעתיק, אחד הפה (כן-הקשורים חלבון) או שלה חלבונים הקשורים קשר הדוק TAZ (תעתיק activator עם מוטיב PDZ), לתוך תאים סופני הבדיל ביעילות יוצרת אוכלוסיות תאים פונקציונלית, ניתן להרחבה, שאינם tumorigenic, עצמיים מבצעית, מולקולרי ניתן להבחין בין שלהם SCs המתאימים רקמות ספציפיות1. דופק של מתמשכת הפה או פעילות טאז לכמה ימים לא מספיק כדי לגרום את המראה של עצמי חידוש SCs סומאטית. זהו מצב יציב זה אינו תלוי ביטוי transgene רציף, כמו זה יכול להיות מועבר דרך התא דורות ללא ביטוי נוסף של הפה/טאז חוץ רחמי1. הפרוטוקול הציג כאן פרטים ההליך המשמש ליצירת דה נובו אפיתל גזע/ובתאים של בלוטת חלב, הלבלב, החל מתאים של רקמות אלה. הליך זה ממלא קופסה שחורה בזירה התכנות/transdifferentiation הנוכחית. המאמץ המרכזי בכיוונים האלה יש אכן כה שבמרכזה תא המעבר למצב תאי גזע (iPSC) pluripotent המושרה, ואחריו המרה של אלה מתחלקים, pluripotent SCs לתוך הבדיל יותר תאים. עם זאת, iPSCs הם tumorigenic פעם הציג את רקמות בוגרות, מעלה את הצורך לפתח פרוטוקולים שלהם התמיינות מלאה ויעילה2. עם זאת, שלב זה בידול, אפילו כאשר הדבר אפשרי, מגיע במחיר של פוטנציאל איכלוס לטווח ארוך של יכולת הרחבה, ארגון עצמי ו עוגב. אלה הן תכונות חיוניות עבור התחדשות האיברים האופייניים למעשה רק של אנדוגני רקמות ספציפיות SCs ושל ה כיום מתואר הפה-induced-SCs (ySCs). באופן דומה, transdifferentiation ישירה של תא אחד סוג אחר באמצעות קוקטיילים של שעתוק שונים גורמים גם ליצור הבדיל תאים חסרי חיוניות proliferative ו stemness פוטנציאליים3.
ההליך המתואר כאן גם מנצל הטכנולוגיה תא צורב הציג לאחרונה, שלפיו SCs אנדוגני ניתן להרחיב, הבדיל שמחוץ4. הפה-induced SCs יכול ליצור SCs להיוות תא צורב גם בתנאי ניסיוני, ביולוגית או מחלה שבה SCs אנדוגני אינם נוכחים. ברצוננו לציין כי ההבדל עם הליכים אחרים התיכנות, הסוג של תא פלסטיות המוקנית על ידי הפה יתאימו להצורה היחידה של לדוגמות מצב דמוי SC המתרחשת ברקמות החי. הכל נראה טוב תכונות כמו SC שויכה רקמות תיקון או הפעלת oncogenic5. למרות לוותר על הומאוסטזיס של רקמות בוגרות מספר, הפה ו/או טאז הם חיוני עבור התחדשות, הגידול והרחבה של SCs סומאטית חוץ גופית1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">10 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:123px;">Rays</td>
			<td style="width:112px;">10LC</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm&#160; cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">15 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430052</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">24-well ultra low attachment plates</td>
			<td style="width:123px;">Costar</td>
			<td style="width:112px;">3473</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">40 mm cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:112px;">352340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">48-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353078</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">50 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430290</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">6-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353046</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">12634028</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPE</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Collagenase, type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018029</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">1705-041</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:123px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:112px;">0503</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">11320033</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">DMSO</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">D2650</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DnaseI</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:112px;">11284932001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">E5134</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FACS tubes (with strainer caps)</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:112px;">352235</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">118208</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#19780&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-EGFP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84041</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-MCS</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84008</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-wtYAP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84009</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:481px;">FUW-tetO-YAPS94A</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84010</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">35050061</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">24020117</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">H3149&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15630-056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human R-Spondin1 (His Tag)</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>11083-H08H-5</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS-X</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab7800&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-8 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab14053&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">&#160;25030081</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">51-9003632</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#174; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0402</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &#248; 94)</td>
			<td style="width:123px;">ROLL</td>
			<td style="width:112px;">18248</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 10x</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM4004XL</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Hamster Anti-Mouse CD61</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">553347</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">551129</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">102222</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I (coating)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">122-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I for 3D culture</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine FGF basic (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td style="width:112px;">450-33</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris BASE&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0,05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waymouth medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31220023</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לבודד תאים העיקרי ולסובב שאותם לתוך גזע/ובתאים (SCs) של אותה שושלת לביטוי ארעית של הגורם שעתוק לחרטט. בשיטה זו, תאים luminal (LD) של בלוטת החלב העכבר מומרים תאים כי התערוכה מאפיינים פונקציונליים המולקולריים של החלב SCs. הפה גם פונה באופן מלא הבדיל הלבלב אקסוקרינית תאים לתוך הלבלב צינור דמוי אבות. באופן דומה, כדי SCs אנדוגני, טבעי, תאי גזע דמוי הפה-induced ("ySCs") ניתן בסופו של דבר להרחיב כמו תא צורב תרבויות לטווח ארוך במבחנה, ללא צורך נוסף של הפה חוץ רחמי/טאז, כפי ySCs חוננו מדינה heritable SC דמוי עצמי המתחדש.
ההליך התיכנות המובאת כאן מציעה את האפשרות ליצור ולהרחיב במבחנה שופט ובתאים של מקורות רקמה שונים החל מתאים. הרחבה פשוטה של תאים סומטיים שמחוץ יש השלכות על רפואה רגנרטיבית, הבנת מנגנונים של הגידול חניכה ועוד, באופן כללי, עבור תא ולימודי ביולוגיה התפתחותית.

דור של yMaSCs סקירה כללית של האסטרטגיה ניסיוני לתכנת ראשי תאים LD החלב על ידי ביטוי ארעית של הפה מוצג איור 1A. ראשי החלב LD בתאי אפיתל כבר טהור על ידי תא לפעיל על-פלורסנט מיון13. איור 1B מייצג את הליך המיון טיפוסית להשיג שלושה ייחודי subpopulations: התאים הבזליים (EpCAMנמוךCD49fגבוההCD61–), תאים Luminal קדמון (LP) (EpCAMגבוההCD49fנמוכהCD61+ ) ותאים LD (EpCAMגבוההCD49fנמוכהCD61–). זהירות gating של subpopulations שלוש הוא חיוני כדי לבודד הכנה טהור של LD תאים, זה מלא מובחנים, לגמרי הצמיחה נעצרה כאשר נזרע במושבה עטין ויוצרים תנאים (ראה איור 1C, עזב את החלונית). לעומת זאת, כאשר המושרה להביע את הפה אקסוגני, LD התאים מתחילים מתרבים כדי ליצור בקלות לזיהוי מושבות צפופות אפיתל בתרבויות קרום המרתף 5% מטריקס ההשעיה (איור 1C). היעילות של התכנות, העיד בסביבות 3% עבור טיפוסי ניסוי, יכול להיות שבוים על ידי ספירת מספר המושבות מעל המספר של תאים בודדים במקור נזרע בתרבויות קרום המרתף מטריקס ההשעיה (איור 1D). מחדש תאים luminal (yMaSCs) ואז ניתן להיכנס 100% קרום המרתף מטריקס תא צורב תרבות תנאים (ראה ערכת ב איור 1A), מארגן את עצמו לתוך מבנים מורכבים, כמו תא צורב להתפתח סביב לומן מרובות, להציג יכולת התחדשות עצמית מדהימה אפילו בהעדר דוקסיציקלין (קרי בהעדר ביטוי הפה הטרנסגניים) (איור 1E). בהיסטולוגיה, organoids yMaSC, נגזר להציג שכבה הבזליים (K14 חיובי), מול המטריקס קרום המרתף מחדש ECM, בשכבה luminal (K8 חיובי), מול חללים כמו לומן בתוך תא צורב (איור 1F). ארכיטקטורה זו היא להבחין מגניחותיה של organoids שהוקמה על ידי ילידי MaSCs (איור 1F).
דור של yDucts סקירה כללית של האסטרטגיה ניסיוני לתכנת acini הלבלב הראשי על-ידי ביטוי ארעית של הפה מוצגת באיור2 א. כל אשכולות acinar מבודדים מן הנפח של רקמת הלבלב על ידי שילוב של דיסוציאציה קלה להדרה גודל באמצעות סינון. הכנה טיפוסי מוצג באיור 2B. לאחר בידוד, האשכולות תא acinar אמורה להופיע כמו השעיה של יחידות acinar אקסוקרינית של גודל הומוגני, עם שום זיהום על ידי האנדוקרינית איונים לנגרהנס או שברי העץ ductal הלבלב ואת דיסוציאציה מינימלי כדי תאים בודדים. זיהום על ידי איונים האנדוקרינית או שברי ductal היא אינדיקציה סינון סלקטיבי לקוי (שלב 2.1.10), כנראה עקב טיפול נוקשה; דיסוציאציה לא רצויים של אשכולות acinar תאים בודדים יכול להיות עקב טיפול collagenase מופרזת או unbuffered פעילות של אנזימים הפרוטאוליטי שפורסמו על ידי רקמת, אשר יכול להיות בלם על ידי טיפול SBTI נוספים.
ניסוי טיפוסי התיכנות acinar מוצג באיור 2C; בתוך 5-7 ימים של תרבות קולגן 3D-המבוסס על הידרוג בנוכחות דוקסיציקלין, הלבלב acini נגזר R26-rtTAM2/tetO-הפהS127A עכברים בקלות להפוך אשכולות דמויי צינור (כי קראנו yDucts), הולחן על ידי דקה טפט של תאי אפיתל להתרבות בסביבה חלל מרכזי המתרחב. יעילות התיכנות, שזה בסביבות 70% עבור ניסוי טיפוסי, ניתן למדוד בקלות כשקלע מספר אשכולות דמויי צינור אוורור מעל המספר הכולל של acini הזריעה (איור דו-ממדי). בקרה שלילית תאים, כלומר R26-rtTAM2 / + תאים או R26-rtTAM2/tetO-הפהS127A נותרו תאים ללא דוקסיציקלין, תמיד נשארות כמו פוסט mitotic אשכולות acinar בתנאים אלה התרבות, כפי שצוין בעבר דיווחו1 14, ,15. YDucts היו יכולים אז להיות passaged ברמה תא בודד לתוך תא צורב מבוססי Matrigel תרבות התנאים16 (ראה ערכת איור2 א), הצגת יכולת התחדשות עצמית מדהימה אפילו בהעדר דוקסיציקלין (קרי בהעדר ביטוי הפה הטרנסגניים) (2E איור).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> איור 1: תאי גזע תאים בידוד של LD החלב העיקרי, אינדוקציה של החלב. (א) ייצוג סכמטי של התהליך ניסיוני אימצה לתכנת מחדש תאים LD החלב העיקרי. (B) נציג FACS-מגרשים הממחישות את הליך המיון טיפוסי לטהר LD תאים. i) חלופה מועדפת תאים הן פיקוח על פי פיזור קדימה ואת הצד של תאים חיים (P1; כחול); ii) האוכלוסייה P1 יש ואז עוד יותר פיקוח על פי פרופיל לין שלה: subpopulation של תאים שושלת היוחסין-שלילי (P2; אפור) נבחרה, למעט תאים hematopoietic היוחסין-חיוביות; iii) האוכלוסייה P2 מחולק ואז של EpCAMגבוהה (P3; צהוב + ירוק) ו- subpopulationsנמוך (P6; אדום) EpCAM; iv) P3 ו- P6 הן ואז עוד יותר פיקוח על פי הפרופיל שלהם CD61/CD49f לתוך subpopulations שלושה: EpCAMנמוךCD49fגבוההCD61– התאים הבזליים (P7; אדום), EpCAMגבוההCD49fנמוכהCD61+ LP תאים (P8; צהוב) EpCAMגבוההCD49fנמוכהCD61 תאים LD– (P9; ירוק). (ג) התמונות הן להמחשה ליכולת של תאים LD, נגוע המבנה המוצע, כדי ליצור מושבות החלב 15 ימים לאחר זריעה במדיום המושבה החלב. רק תאים להפוך לבטא הפה המושבה יוצרי תאים, ואילו תאי בקרה שלילית (EGFP-נגוע) להישאר בבידוד-גידול תאים בודדים. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ד) כימות של המושבה ויוצרים את היכולת של תאי המצוין, כמו (C). הנתונים מוצגים אומר + ש, נציג של חמישה ניסויים עצמאי, כל אחד עם משכפל טכני שש. (ה) נציג תמונה של הפה מחדש החלב כמו תאי גזע תאים (yMaSCs) לאחר 12 ימים לתוך תא צורב תרבות התנאים טריים תלת מימדי 100% קרום המרתף מטריקס הידרוג בהיעדר דוקסילין. סרגל קנה מידה = 100 μm. (נ) immunofluorescence נציג תמונות עבור דה מרקר הבזליים K14 (ירוק) ו- the luminal marker K8 (אדום) של organoids נגזר תאי המצוין, לאחר 12 ימים לתוך תא צורב תרבות תנאים. סרגל קנה מידה = 10 μm. איור זה מתרבה. et al., 2016 Panciera1. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> איור 2 : בידוד של ראשי בתאי הלבלב acinar, אינדוקציה של אבות הלבלב. (א) ייצוג סכמטי של התהליך ניסיוני אימצה לתכנת העיקרי בתאי acinar הלבלב אקסוקרינית. (B) תמונה ייצוגית של ראשי acini הלבלב רק לאחר ההליך בידוד (שלב 2.1.14). הכנת acinar אמורה להופיע כמו השעיה הומוגנית של אשכולות acinar, עם נוכחות מינימלית של תאים בודדים. סרגל קנה מידה = 400 μm. (ג) להחליפן בתמונות של ראשי acini הלבלב נגזר R26-rtTAM2 (לוחות העליון)או R26-rtTAM2; tetO-הפהS127A (להוריד לוחות) עכברים תרבותי ב קולגן תלת-ממדי-מבוסס הידרוג במשך 5 ימים עם או בלי דוקסיציקלין (הדוקסיציקלין), כמצוין. רק לבטא הפה acini העיקרי להמיר תאים לגדול כמו ציסטה דמוי תא צורב אחרי תוספת דוקסיציקלין. גודל ברים = 70 μm. (ד) כימות של היכולת של הלבלב acini ליצור ductal organoids על ביטוי הטרנסגניים הפה כמו (C). הנתונים מוצגים אומר + ש, נציג של חמישה ניסויים עצמאית, הופיעה עם משכפל טכני ארבע. (ה) נציג תמונה של reprogramed-הפה ductal כמו תאים (yDucts) לאחר שלושה פסוקים טריים תלת מימדי 100% קרום המרתף מטריקס הידרוג בהיעדרו של דוקסיציקלין. סרגל קנה מידה = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">בידוד של תאים החלב ראשי</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 + chelating פתרון</td>
			<td>חנות ב 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0.02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">קולגן אני ציפוי פתרון</td>
		</tr>
<tr>
<td>חומצה אצטית 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>עכבר זנב קולגן (ציפוי)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון dispase</td>
			<td>חנות ב 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>דיסוציאציה בינוני</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון מניות hyaluronidase</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון מניות collagenase אני</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון haemolytic</td>
			<td>חנות ב 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>מלון NH4Cl פתרון</td>
			<td>חלקים 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 g/L</td>
			<td>9 חלקים</td>
		</tr>
<tr>
<td>להתאים את ה-pH ל 7.2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>חנות ב 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון מניות hyaluronidase</td>
			<td>מסנן 0.2 µm, חנות ב 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase מן האשכים שור (אבקת)</td>
			<td>2,000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>סודיום פוספט מאגר 1 מ' pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>מלון NH4Cl פתרון</td>
			<td>לאחסן בבית השגריר טי.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>מלון NH4קלרנית</td>
			<td>7.1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>להתאים את ה-pH ל 7.65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>מיון פתרון</td>
			<td>מסנן 0.2 µm, חנות ב 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>לשטוף בינוני #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>לשטוף בינוני #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>החלב בינוני תרבות 2D</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>הפארין</td>
			<td>4 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>-גלוטמין</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>מאתר bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF מאתר</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">אינדוקציה, Passaging של yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">המושבה החלב בינוני</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>הפארין</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>-גלוטמין</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (להוסיף מיד לפני זריעה)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>מאתר bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF מאתר</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">החלב בינוני תא צורב</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12 מתקדם</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>הפארין</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>הראש האנושי</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>מאתר bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF מאתר</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>µg 1/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: דור של yMaSCs. ההרכב של כל מדיה תרבות שונים ואת הפתרונות הנדרשים עבור בידוד של ראשי תאים LD החלב ו אינדוקציה של yMaSCs (סעיף 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">בידוד של ראשי acini הלבלב</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar תרבות בינוני</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>µg 50/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>דקסמתזון</td>
			<td>µg 1/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>בינוני של Waymouth</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">שטיפת acinar בינוני</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI בינוני</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">שחזור acinar בינוני</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar תרבות בינוני</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase אני פתרון A</td>
		</tr>
<tr>
<td>שטיפת acinar בינוני</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון מניות collagenase אני</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>חנות ב 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (באגירה פוספט תמיסת מלח)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון מניות collagenase אני</td>
			<td>חנות ב-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase, סוג אני (אבקת)</td>
			<td>6,000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passaging של הלבלב organoids</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase אני הפתרון B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון מניות collagenase אני</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">הלבלב בינוני תא צורב</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM מתקדם/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>גסטרין</td>
			<td>10 ננומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF10 אנושי</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>הראש האנושי</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF מאתר</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-אצילוסיסטין</td>
			<td>1.25 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
			<td>10 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>עט/סטרפ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: דור של yDucts. ההרכב של כל מדיה תרבות שונים ואת הפתרונות הנדרשים עבור בידוד של תאים acinar הראשית, אינדוקציה, passaging של yDucts (סעיף 2).

Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

הזמינות של SCs סומאטית הוא קריטי עבור רפואה רגנרטיבית, מידול המחלה ולהשיג תובנה SC מאפיינים. כאן אנו מציגים אסטרטגיות ניסיוני לתכנת, חוץ גופית בתוך, הבדיל תאים בוגרים לתאי גזע רקמות ספציפיות ניתן להרחבה/קדמון המקביל שלהם על-ידי הביטוי ארעית של יחיד activator תעתיק שיתוף הפה.

דה נובו דור בתאי גזע סומאטית מאת הפה/טאז

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Generation of Human CD40-activated B cells

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

חוכמת חלבון: Workbench ל<em&gt; בסיליקון</em&gt;<em&gt; דה נובו</em&gt; עיצוב של ביומולקולות

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

בתכנות מחדש vivo של תאים סומטיים למבוגרים לpluripotency ידי ביטוי יתר של גורמי יאמאנאקה

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...