Name: de novo generation of somatic stem cells by yap/taz
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

Vi takker F. Camargo for gave Tejo-YAPS127A mus; R26-rtTAM2 mus (stock #006965) ble kjøpt fra Jackson laboratoriet. Vi takker Chiara Frasson og Giuseppe Basso hjelpen FACS prosedyrer. Dette arbeidet er støttet av AIRC spesielle Program molekylær Clinical Oncology '' 5 promille '' og en AIRC PI-Grant S.P, og Epigenetics flaggskip prosjektet CNR-Miur gir S.P. Dette prosjektet har mottatt finansiering fra europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjonsprogram (gi avtalen DENOVOSTEM nr. 670126).

<ol>
	<li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage.">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration.">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281 (2014).</li><li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation.">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li><li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program.">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li><li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis.">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li><li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration.">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+of+mutant+KRAS,+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).</li><li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+at+the+Roots+of+Cancer.">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li><li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response.">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates.">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li><li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia.">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li><li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage.">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li><li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration.">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li><li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration.">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration.">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li><li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease.">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Her presenterer vi for å omprogrammere ex vivo terminalt differensiert epitelceller av ulike vev i sine tilsvarende vev-spesifikke progenitor celler (eller ySCs) av forbigående uttrykk for YAP, som rapportert tidligere1. Vi har detaljerte fremgangsmåter: en slik at omprogrammering av FACS-renset celler gjennom lentiviral vektorer og en ny en som unngår viral infeksjon og tar nytte av transgene YAP uttrykk. Hver protokoll presenterer en effektiv strategi for å isolere og kultur primære differensierte celler og en strategi for å fremtvinge eksogene YAP genuttrykk i differensierte celler, genererer de novo somatiske vev-spesifikke utvides stilk celler (se skjemaer i tallene 1A og 2A).
Vi viste at isolasjon strategier her presentert effektivt isolere en ren befolkning av differensierte celler, som demonstrert av det faktum at vi aldri oppdaget noen utvekst fra negativ kontroll prøver (tall 1 c og 2 C).
Lentiviral vektorer brukt i denne studien omprogrammere primære mammary LD celler, er doxycycline induserbart, tilbyr muligheten for en stram kontroll av transgene uttrykket; Dette gjør det mulig for å slå på og av eksogene YAP uttrykk på vil. Spesiell oppmerksomhet bør plasseres unngå bruk av en overdreven viral titer, så dette kan være skadelig tanke reprogramming effektivitet. Ved primær acinar celler byttet vi til en fullt transgene tilnærming for å få en YAP-avhengige omprogrammering med minimal manipulasjoner. Denne siste strategien er også spesielt egnet for primære bukspyttkjertelen acini, isolert acinar klynger er neppe mottakelig for lentiviral infeksjon og svært skjøre. Transgene strategi ansatt tilbyr samme fordelen av doxycycline-avhengige lentiviral vektorer for tett kontroll av genuttrykk. Videre bærer transgene strategien utnyttes med primære bukspyttkjertelen acini fordelen av en mye høyere reprogramming effektivitet sammenlignet den viral-indusert omprogrammering mammary LD celler. Utover de ulike iboende plastisitet knyttet til cellene stammer fra forskjellige vev, kan høyere frekvensen av bukspyttkjertelen omprogrammering utledes fra høyere effektiviteten av uttrykk forbundet til uniform og autonome YAP uttrykk i alle explanted celler. Spesielt, har vi vist at eksogene YAP er ikke lenger nødvendig etter generasjon av ySCs (yMaSC kolonier og yDucts), uten at det påvirker deres selvtillit fornyelse kapasitet. Dette er fordi ySCs reaktivere endogene YAP/TAZ og bruke dem for selvtillit fornyelse når eksogene YAP slås av1.
Vi validert forestillingen om at ySCs faktisk kommer fra differensierte celler ved å kontrollere cellen av opprinnelsen til våre reprogramming eksperimenter gjennom genetisk avstamning-sporing valideringer1.
Omfattende karakteriseringySCs viser at YAP-indusert omprogrammering genererer normal somatiske SCs1 som jeg) på transcriptomic nivå, ySCs vise massiv overlapper med innfødte SCs; II) ySCs vise differensiering potensielle og kan generere en multilineage avkom alltid begrenset til identiteten til deres vev av opprinnelse; III) ikke-tumorigenic når transplantert i vivoySCs er ikke forvandlet.
Her beskriver vi også prosedyrer for å opprettholde og utvide i kultur både yMaSCs og yDucts som organoids innebygd i 100% kjelleren membran matrise hydrogels. Disse forholdene tillater for selv-organisering av ySCs i tredimensjonale organoids som sikrer opprettholdelse av stemness egenskaper langsiktig i kultur, slik at å utvide dette stammer bestander på vilje for nedstrøms analyser og programmer. For ukjente årsaker vi kunne yMaSC organoids ved å plassere infisert LD celler direkte i organoid oppdrettsforholdene 7 dager etter doxycycline behandling i plast vev kultur plate; med andre ord, er det mellomliggende vekst trinnet i mammary kolonien forhold viktig. I våre hender krever enda innfødte MaSCs mammary kolonien betingelser før passaging i organoid kultur. Videre oppnås mest effektive organoid resultatet når vi unngå dissociating primære koloniene i enkeltceller, men heller overføre intakt koloniene i organoid kultur forhold.
Organoid oppdrettsforholdene bærer også fordelen av å gi muligheten til å cryopreserve ySCs, forutsatt at organoids gjenopprettes fra deres matriser, unngå celle dissosiasjon før kryonisk bevaring i nitrogen bad.
YAP omprogrammering prosedyren presentert kan konvertere distinkt forskjellige celletyper avledet fra forskjellige voksen vev til deres tilsvarende vev-spesifikke stamceller (vi har testet den med cellene mammary, bukspyttkjertelen og neuronal)1. Til forskjell fra iPSCs eller andre reprogramming innsats, kan YAP/indusert SCs opprettholde minnene om deres vev av opprinnelse. Av notatet, de differensiering av somatiske celler i celler med stilk-lignende egenskaper er den eneste formen for celle skjebne plastisitet og omprogrammere observert i vivo, for eksempel etter vevsskade, og å støtte sårheling5,17 , 18 , 19 , 20. det er bemerkelsesverdig at YAP og TAZ er hovedsakelig unnværlig for normal homeostase, men avgjørende for reparasjon av vev i flere vev11,21. Konsekvent med en fysiologisk funksjon av reprogramming trinnene som beskrives her, vist YAP/TAZ nylig seg å være nødvendig i intestinal gjenfødelse musen modeller pasienter med ulcerøs kolitt ved å få en konvertering av voksen intestinal celler i en reparasjon epitel som viser funksjonene i fosterets gut19. YAP omprogrammering dermed utvider gjeldende indusert celle plastisitet strategier ved å gi et middel til å generere somatiske stamceller, en stat som har vært så langt utfordrende for å fange i vitro. Denne kan hvis utvidet også til menneske-avledet celler, ha bred relevans fra regenerativ medisin programmer til studiet av somatisk stemness og for utvidelse av somatiske stilk celler i vitro.

Vev-spesifikke somatiske stamceller (SCs) er avgjørende for vev fornyelse og reparasjon etter skader. Muligheten til å enkelt isolere og unlimitedly utvide ex vivo somatiske SCs representerer et kritisk problem for potensielle regenerativ Therapy og SC programmer i grunnforskning og sykdom modellering. Fremgang i denne retningen, har imidlertid vært begrenset av vanskelighetene med å fange SC delstaten ulike epithelial organer i vitro. Faktisk i flere voksen vev bosatt SCs kan finnes ikke, eller ikke være lett tilgjengelig eller deres antall og regenererende potensial kan bli erodert av aldring eller sykdom forhold. I 2016, begynte vi å fylle dette gapet ved rapportering som uttrykk for en enkelt transcriptional coactivator, YAP (ja-assosiert protein) eller dens nært beslektede protein TAZ (transcriptional aktivator med en PDZ motiv), i terminalt differensierte celler effektivt skaper funksjonelle, utvidbare, ikke-tumorigenic, autologous celle populasjoner som er operativt og molecularly utvisket fra deres tilsvarende vev-spesifikke SCs1. En puls av vedvarende YAP eller TAZ dagene er tilstrekkelig til å indusere utseendet til selvstendig fornye somatiske SCs. Dette er en stabil tilstand som er ikke lenger avhengig av kontinuerlig transgene uttrykk, som det kan overføres gjennom cellen generasjoner uten videre uttrykk for ektopisk YAP/TAZ1. Protokollen presenteres her detaljer prosedyren brukes til å generere de novo epithelial stammen/stamfar celler melkekjertlene og bukspyttkjertelen, fra differensierte celler av disse vev. Denne prosedyren fyller en svart boks i gjeldende omprogrammering/transdifferentiation arena. Største innsats i disse retningene har faktisk så langt sentrert på cellen overgang til en indusert pluripotent stamceller (iPSC) tilstand, etterfulgt av konvertering av disse embryonale og pluripotent SCs i mer differensierte celler. Men er iPSCs tumorigenic en gang introdusert i voksen vev, øke behovet for å utvikle protokoller for deres fullstendig og effektiv differensiering2. Men kommer dette differensiering trinnet, selv når det er mulig, på prisen på langsiktige utvidelsesmuligheter, selv-organisering og orgel repopulation potensialer. Disse er viktige egenskaper for organ gjenfødelse som faktisk er typisk bare av endogene vev-spesifikke SCs og tiden beskrevet YAP-indusert SCs (ySCs). Tilsvarende differensierte direkte transdifferentiation av én celle type til en annen ved hjelp av cocktailer av ulike transkripsjon faktorer også generere celler som mangler essensielle proliferativ og stemness potensielle3.
Fremgangsmåten som er beskrevet her tar også nytte av den nylig introdusert organoid teknologien, som endogene SCs kan utvides og differensiert ex vivo4. YAP-indusert SCs kan generere organoid-forming SCs selv i eksperimentell, biologiske eller sykdom som endogene SCs ikke finnes. Vi ønsker å merke seg at forskjellen med andre reprogramming, type celle plastisitet formidles av YAP kan tilsvare den eneste formen for hjemfall til SC-lignende status som oppstår i levende vev. Reacquisition av SC-lignende trekk er tilknyttet tissue reparasjon eller kreftfremkallende aktivisering5. Selv om unnværlig for homeostase av flere voksen vev, er YAP og/eller TAZ helt avgjørende for regenerasjon, tumor vekst og ekspansjon av somatiske SCs i vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">10 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:123px;">Rays</td>
			<td style="width:112px;">10LC</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm&#160; cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">15 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430052</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">24-well ultra low attachment plates</td>
			<td style="width:123px;">Costar</td>
			<td style="width:112px;">3473</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">40 mm cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:112px;">352340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">48-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353078</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">50 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430290</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">6-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353046</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">12634028</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPE</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Collagenase, type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018029</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">1705-041</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:123px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:112px;">0503</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">11320033</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">DMSO</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">D2650</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DnaseI</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:112px;">11284932001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">E5134</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FACS tubes (with strainer caps)</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:112px;">352235</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">118208</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#19780&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-EGFP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84041</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-MCS</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84008</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-wtYAP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84009</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:481px;">FUW-tetO-YAPS94A</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84010</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">35050061</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">24020117</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">H3149&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15630-056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human R-Spondin1 (His Tag)</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>11083-H08H-5</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS-X</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab7800&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-8 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab14053&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">&#160;25030081</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">51-9003632</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#174; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0402</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &#248; 94)</td>
			<td style="width:123px;">ROLL</td>
			<td style="width:112px;">18248</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 10x</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM4004XL</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Hamster Anti-Mouse CD61</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">553347</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">551129</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">102222</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I (coating)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">122-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I for 3D culture</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine FGF basic (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td style="width:112px;">450-33</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris BASE&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0,05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waymouth medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31220023</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

Her presenterer vi for å isolere primære differensierte celler og slå dem i stammen/stamfar celler (SCs) av den samme linjen av forbigående uttrykk av transkripsjon faktor YAP. Med denne metoden konverteres luminal differentiated (LD) celler i melkekjertlene musen til cellene som viser molekylære og funksjonelle egenskaper mammary SCs. YAP også blir fullt differensiert bukspyttkjertelen exocrine cellene i bukspyttkjertelen duct-lignende progenitors. Tilsvarende til endogene, naturlig SCs, kan YAP-indusert stilk-lignende celler ("ySCs") til slutt utvides som organoid kulturer langsiktig i vitro, uten ytterligere behov for ektopisk YAP/TAZ, som ySCs er utstyrt med en arvelig selv fornyende SC-lignende tilstand.
Reprogramming prosedyren presenteres her tilbyr muligheten til å generere og utvide i vitro progenitor celler av ulike vev kilder fra differensierte celler. Enkel utvidelse av somatiske celler ex vivo har implikasjoner for regenerativ medisin, forståelse mekanismer av svulsten og, mer generelt, for celle og utviklingsbiologi studier.

Generering av yMaSCs En oversikt over den eksperimentelle strategien for å omprogrammere primære mammary LD celler av forbigående uttrykk for YAP vises i figur 1A. Primære mammary LD epitelceller blir renset ved fluorescerende-aktivert celle sortering13. Figur 1B viser en typisk sortering prosedyre å få tre distinkte subpopulasjoner: Basal celler (EpCAMlavCD49fhøyCD61-), Luminal stamfar (LP) celler (EpCAMhøyCD49flavCD61+ ) og LD celler (EpCAMhøyCD49flavCD61-). Forsiktig gating av de tre subpopulasjoner er avgjørende for å isolere en ren forberedelse av LD celler, som er fullt differensiert og helt vekst arrestert når seeded i melkekjertlene kolonien danner forhold (se figur 1 c, venstre panel). Motsatt, når indusert uttrykke eksogene YAP, LD celler starter proliferating å danne lett gjenkjennelig tett epithelial kolonier i 5% kjelleren membran matrix suspensjon kulturer (figur 1 c). Effektiviteten av reprogramming, attestert rundt 3% for en typisk eksperimentet, kan være scoret ved å telle antall kolonier over antall enkeltceller opprinnelig seeded i kjelleren membran matrix suspensjon kulturer (figur 1 d). Deretter omprogrammeres luminal celler (yMaSCs) kan passering i 100% kjelleren membran matrise organoid kultur forhold (se ordningen i figur 1A), selv organisere i komplekse organoid-lignende strukturer som utvikler rundt flere lumen og vise bemerkelsesverdig selvtillit fornyelse evne til selv i fravær av doxycycline (dvs. i fravær av transgene YAP uttrykk) (figur 1E). Histologisk, yMaSC-avledet organoids vise et basale lag (K14 positive), overfor kjelleren membran matrix rekonstituert ECM og et luminal lag (K8 positiv), overfor lumen-lignende hulrom i organoid (figur 1F). Denne arkitekturen er utvisket fra av organoids dannet av innfødte MaSCs (figur 1F).
Generering av yDucts En oversikt over den eksperimentelle strategien å omprogrammere primære bukspyttkjertelen acini av forbigående uttrykk for YAP vises i figur 2A. Hele acinar klynger er isolert fra hoveddelen av bukspyttkjertelen vev av en kombinasjon av mild dissosiasjon og størrelse eksklusjon gjennom filtrering. En typisk forberedelse vises i figur 2B. Etter isolasjon, skal acinar celle klynger vises som en suspensjon av exocrine acinar enheter av homogen størrelse, med ingen kontaminering av endokrine Langerhans holmer eller fragmenter av bukspyttkjertelen ductal treet og minimal avstandtagen til enkeltceller. Forurensning av endokrine holmer eller ductal fragmenter er en indikasjon på mangelfull selektiv filtrering (trinn 2.1.10), muligens på grunn av harde håndtering; uønsket dissosiasjon av acinar klynger til enkeltceller kan skyldes overdreven collagenase behandling eller Ubufret aktivitet av proteolytisk utgitt av vev, som kan være dempet av ekstra SBTI behandling.
En typisk acinar reprogramming eksperiment vises i figur 2C; innen 5-7 dager etter kultur i 3D kollagen-basert hydrogel i nærvær av doxycycline, bukspyttkjertelen acini avledet fra R26-rtTAM2/Tejo-YAPS127A mus lett slå inn duct-lignende klynger (som vi kalt yDucts), komponert av en tynn monolayer av epitelceller som sprer rundt en voksende sentral hulrom. Reprogramming effektiviteten, som er rundt 70% for en typisk eksperiment, kan måles lett av scoring antallet duct-lignende klynger over antall seeded acini (figur 2D). Kontrollen negative celler, som er R26-rtTAM2 / + celler eller R26-rtTAM2/Tejo-YAPS127A celler igjen uten doxycycline, alltid forbli etter mitotisk acinar klynger i disse kultur forhold, som tidligere rapportert1 ,14,15. Omprogrammeres yDucts kan deretter bli passaged på enkeltcelle nivå i Matrigel-baserte organoid kultur forhold16 (se ordningen i figur 2A), viser bemerkelsesverdig selvtillit fornyelse evne til selv i fravær av doxycycline (dvs. i fravær av transgene YAP uttrykk) (figur 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figur 1: Isolasjon av primære mammary LD celler og induksjon av mammary stamceller. (A) skjematisk fremstilling av den eksperimentelle prosedyren vedtatt for å omprogrammere primære mammary LD celler. (B) representant FACS-tomter illustrerer en typisk sortering prosedyre å rense LD celler. i) avstand celler er gated ifølge fremover og side scatter for levende celler (P1, blå); II) befolkningen P1 deretter videre Portes ifølge sin Lin profil: subpopulasjon avstamning-negativ celler (P2, grå) velges, unntatt avstamning-positive blodkreft celler. III) befolkningen P2 deles så inn i en EpCAMhøy (P3; gul + grønn) og en EpCAMlav (P6, rød) subpopulasjoner; IV) P3 og P6 er deretter videre gated etter sin CD61/CD49f-profil i tre subpopulasjoner: EpCAMlavCD49fhøyCD61- Basal celler (P7, rød), EpCAMhøyCD49flavCD61+ LP celler (P8, gul) og EpCAMhøyCD49flavCD61- LD celler (P9, grønn). (C) bilder er illustrerende for LD celler, infisert med de angitte konstruerer, evnen til å danne mammary kolonier 15 dager etter seeding mammary kolonien medium. Bare uttrykk for YAP celler sving inn colony-forming celler, mens negativ kontroll celler (EGFP-infisert) forblir som vekst-arrestert enkeltceller. Skala bar = 50 μm. (D) kvantifisering av kolonien danner evne til angitte celler, som (C). Dataene presenteres som betyr + SD og er representant for fem uavhengige eksperimenter, hver med seks tekniske gjentak. (E) representativt bilde av YAP-omprogrammeres mammary stilk cellen som celler (yMaSCs) etter 12 dager i organoid kultur forhold i frisk tredimensjonale 100% kjelleren membran matrix hydrogel i fravær av Doxycycline. Skala bar = 100 μm. (F) representant immunofluorescence bilder for basale markøren K14 (grønn) og luminal markøren K8 (rød) av organoids avledet fra de angitte cellene, etter 12 dager i organoid kultur forhold. Skala bar = 10 μm. Dette tallet er gjengitt fra Panciera et al., 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figur 2 : Isolering av primære bukspyttkjertelen acinar celler og induksjon av bukspyttkjertelen progenitors. (A) skjematisk fremstilling av den eksperimentelle prosedyren vedtatt for å omprogrammere primære bukspyttkjertelen exocrine acinar celler. (B) representativt bilde av primære bukspyttkjertelen acini bare etter isolasjon prosedyren (trinn 2.1.14). Acinar preparatet skal vises som en homogen suspensjon av acinar sektorgrupper, med minimal tilstedeværelsen av enkeltceller. Skala bar = 400 μm. (C) representant bilder av primære bukspyttkjertelen acini avledet fra R26-rtTAM2 (øvre panel)eller R26-rtTAM2; Tejo-YAPS127A (lavere paneler) mus og kultivert i 3D kollagen jeg-basert hydrogel for 5 dager med eller uten Doxycycline (doxy), som angitt. Bare konvertere uttrykk for YAP primære acini cellene vokser som cyste som organoid etter Doxycycline. Skalere barer = 70 μm. (D) kvantifisering av bukspyttkjertelen acini evnen til å danne ductal organoids på transgene YAP overuttrykte som (C). Dataene presenteres som betyr + SD og er fem uavhengige eksperimenter, med fire tekniske gjentak. (E) representativt bilde av YAP-reprogramed ductal-lignende celler (yDucts) etter tre passasjer i frisk tredimensjonale 100% kjelleren membran matrix hydrogel i fravær av Doxycycline. Skala bar = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolering av primære mammary celler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 + chelaterande løsning</td>
			<td>Butikken på 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0.02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagen jeg belegg løsning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eddiksyre 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotte hale kollagen (belegg)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase løsning</td>
			<td>Butikken på 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dissosiasjon Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase lagerløsning</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lagerløsning collagenase jeg</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Haemolytic løsning</td>
			<td>Butikken på 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl løsning</td>
			<td>1 deler</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 finans</td>
			<td>9 deler</td>
		</tr>
<tr>
<td>justere pH til 7.2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Butikken på 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase lagerløsning</td>
			<td>Filteret 0,2 µm, butikken på 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase fra storfe testiklene (pulver)</td>
			<td>2000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium fosfat Buffer 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl løsning</td>
			<td>Lagre på T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7.1 finans</td>
		</tr>
<tr>
<td>justere pH til 7.65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sortering løsning</td>
			<td>Filteret 0,2 µm, butikken på 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vask Medium #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vask Medium #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mammary 2D kultur medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Induksjon og Passaging av yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mammary kolonien Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (legge umiddelbart før såing)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mammary Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avansert DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>menneskelige Noggin</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: generasjon yMaSCs. Sammensetningen av alle forskjellige kultur medier og lobbyer for isolering av primære mammary LD celler og induksjon av yMaSCs (del 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolering av primære bukspyttkjertelen acini</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar kultur Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deksametason</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth's Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar vask Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar utvinning Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar kultur Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase jeg løsningen A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar vask Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Lagerløsning collagenase jeg</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Butikken på 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (fosfat-bufret saltvann)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lagerløsning collagenase jeg</td>
			<td>Butikken på 20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase, type jeg (pulver)</td>
			<td>6000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passaging av bukspyttkjertelen organoids</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase jeg løsningen B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Lagerløsning collagenase jeg</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bukspyttkjertelen Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avansert DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrin</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>menneskets FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>menneskelige Noggin</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nikotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penn/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: generasjon yDucts. Sammensetningen av alle forskjellige kultur medier og lobbyer for isolering av primære acinar celler og induksjon og passaging av yDucts (inndeling 2.)

Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Tilgjengeligheten av somatiske SCs er avgjørende for regenerativ medisin, sykdom modellering og få innsikt i SC egenskaper. Presenterer her vi eksperimentelle strategier for å omprogrammere, i vitro, atskilte voksen celler til sine tilsvarende utvides vev-spesifikke stem/stamfar celler av forbigående uttrykk for enkelt transcriptional co aktivatoren YAP.

De Novo Generasjon av somatiske stamceller ved YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Menneskelige Somatiske celler i Utførte pluripotent stamceller (iPSCs) Bruke retrovirale Vector med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein visdom; Workbench for<em&gt; I silikon</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design av biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Omprogrammering av Adult somatiske celler til pluripotency ved Overuttrykte av Yamanaka Faktorer

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...