Name: de novo generation of somatic stem cells by yap/taz
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

Vi tackar F. Camargo för gåvan av tetO-YAPS127A möss; R26-rtTAM2 möss (lager #006965) köptes från The Jackson Laboratory. Vi tackar Chiara Frasson och Giuseppe Basso för hjälp med FACS förfaranden. Detta arbete stöds av AIRC särskilda Program molekylär klinisk onkologi '' 5 promille '' och en AIRC PI-Grant till S.P och epigenetik flaggskeppsprojekt CNR-Miur beviljar för S.P. Detta projekt har fått finansiering från de Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s Horisont 2020 för forskning och innovation (bidragsöverenskommelse DENOVOSTEM nr 670126).

<ol>
	<li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage.">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration.">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281 (2014).</li><li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation.">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li><li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program.">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li><li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis.">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li><li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration.">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+of+mutant+KRAS,+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).</li><li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+at+the+Roots+of+Cancer.">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li><li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response.">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates.">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li><li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia.">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li><li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage.">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li><li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration.">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li><li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration.">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration.">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li><li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease.">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li></ol>

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Här presenterar vi protokoll för att programmera ex vivo terminalt differentierade epitelceller i olika vävnader i deras motsvarande vävnadsspecifika stamceller (eller ySCs) av övergående uttryck av YAP, som tidigare rapporterats1. Vi har detaljerade två förfaranden: en så att omprogrammering av FACS-renat celler genom lentiviral vektorer och en andra som undviker virusinfektion och tar fördel av transgena YAP uttryck. Varje protokoll presenterar en effektiv strategi för att isolera och odla primära differentierade celler och en strategi för att tvinga exogena YAP genuttryck i differentierade celler, genererar de novo somatisk vävnad-specifika utbyggbart stamceller (se system i figurerna 1A och 2A).
Vi visat att isolering strategier här presenteras effektivt isolera en ren population av differentierade celler, vilket framgår av det faktum att vi aldrig upptäckt någon utväxt från negativa kontrollprover (siffrorna 1 c och 2 C).
Lentiviral vektorer används i denna studie för omprogrammering av primära mjölkkörtlar LD celler är doxycyklin inducerbara, erbjuder möjligheten att en sträng kontroll av transgenens uttryck; Detta gör för att slå på och av exogena YAP uttryck vid kommer. Särskild uppmärksamhet bör placeras i undvika användning av en överdriven viral titer, eftersom detta kan vara skadligt i form av omprogrammering effektivitet. När det gäller primära acinar celler bytte vi till en fullt transgena strategi att få en YAP-beroende omprogrammering med minimal manipulationer. Denna sistnämnda strategi är också speciellt lämplig för primära bukspottskörteln acini, som isolerade acinar kluster är knappast mottaglig för lentiviral infektion och mycket ömtålig. Den transgena strategi anställd erbjuder samma fördel av doxycyklin-beroende lentiviral vektorer för tight kontroll av genuttryck. Transgena strategin utnyttjas med primära bukspottskörteln acini bär dessutom den extra fördelen av en mycket högre omplanering effektivitet jämfört med viral-inducerad omprogrammering av mjölkkörtlar LD celler. Utöver olika inneboende plasticitet är associerad till celler som härrör från olika vävnader, kan den högre frekvensen av bukspottskörteln omprogrammering härledas från uttryck som är associerat till enhetliga och självständiga YAP uttryck i alla högre effektivitet explanterad celler. Vi har bland annat visat att exogena YAP inte längre behövs efter generation av ySCs (yMaSC kolonier och yDucts), utan att det påverkar deras självförnyelse kapacitet. Detta beror på att ySCs återaktivera endogena YAP/TAZ och använda dem för självförnyelse när exogena YAP är avstängd1.
Vi validerat uppfattningen att ySCs verkligen ur differentierade celler genom att kontrollera cellen ursprungsland i våra omplanering experiment genom genetiska härstamning-tracing valideringar1.
Omfattande karakteriseringav ySCs visar att YAP-inducerad omprogrammering genererar normal somatisk SCs1 som jag) på transcriptomic nivå, ySCs Visa massiva överlappningar med infödda SCs; (II) ySCs Visa differentiering potentiella och kan generera en Multilinjärt avkomman alltid begränsad till identiteten på deras vävnad ursprung. (III) ySCs är icke-omvandlad och icke-tumörframkallande när transplanterade i vivo.
Här beskriver vi också förfaranden för att upprätthålla och utveckla kultur både yMaSCs och yDucts som organoids inbäddade i 100% basalmembranet matrix hydrogels. Dessa villkor tillåta för självorganisering av ySCs i tredimensionella organoids som garanterar upprätthållandet av stemness egenskaper långsiktiga i kultur, gör det möjligt att expandera dessa stamceller populationer på kommer för nedströms analyser och applikationer. Av okänd anledning, vi misslyckats med att få yMaSC organoids genom att placera infekterade LD celler direkt i organoid odlingsbetingelser 7 dagar efter doxycyklin behandling i plast vävnadsodling plattan; med andra ord, är de mellanliggande tillväxt steget i mjölkkörtlar kolonin villkor viktigt. I våra händer kräver även infödda MaSCs mjölkkörtlar kolonin förhållanden innan passaging i organoid kultur. Dessutom erhålls den effektivaste organoid utväxten när vi undvika separera primära kolonierna i enstaka celler, men snarare överför intakt kolonierna till organoid odlingsbetingelser.
Organoid odlingsbetingelser bära också fördelen av att ge möjlighet att frysa ySCs, förutsatt att organoids återvinns från deras matriser, undvika cell dissociation innan frysförvaring i kväve bad.
Den YAP omprogrammering proceduren presenteras kan konvertera olika differentierade celltyper som härrör från olika vuxna vävnader i deras motsvarande vävnadsspecifika stamceller (vi har testat det med hjälp av mjölkkörtlar, pankreas och neuronala celler)1. Till skillnaden från iPSCs eller andra omplanering ansträngningar, kan YAP/inducerad SCs underhålla minnen av deras vävnad av ursprung. Notera de differentiering av somatiska celler in i celler med stam-liknande egenskaper är den enda formen av cell öde plasticitet och omprogrammering observerade in vivo, till exempel efter vävnadsskada och stödja sårläkning5,17 , 18 , 19 , 20. det är anmärkningsvärt att YAP och TAZ är till stor del överflödiga för normala homeostas men avgörande för vävnad reparera i flera vävnader11,21. Konsekvent med en fysiologisk funktion av omplanering stegen som här beskrivs, har YAP/TAZ nyligen visat att krävas i intestinal förnyelse i musmodeller av patienter med ulcerös kolit genom att orsaka en omvandling av vuxen intestinala celler in i en reparation epitel som visar funktioner av fostrets gut19. YAP omprogrammering således expanderar de nuvarande inducerad cell plasticitet strategierna genom att tillhandahålla ett sätt att generera somatiska stamceller, en stat som hittills har utmanande för att fånga in vitro. Detta tillvägagångssätt, kan om utvidgas också till människa celler, ha bred betydelse från regenerativ medicin program till studien i den somatiska stemness staten och för expansion av somatiska stamceller celler in vitro.

Vävnadsspecifika somatiska stamceller (SCs) är kritiska för vävnad förnyelse och reparation efter skada. Möjligheten att enkelt isolera och obegränsat expandera ex vivo somatiska SCs representerar en kritisk fråga för potentiella regenerativ terapier samt för SC tillämpningar inom grundforskning och sjukdom modellering. Framsteg i denna riktning, har dock varit begränsat av svårigheten att fånga SC delstaten olika epiteliala organ in vitro. Faktiskt i flera vuxna vävnader bosatt SCs kan finns inte, eller inte vara lättillgänglig eller deras antal och regenerativ potential kan urholkas av åldrande eller sjukdom förhållanden. 2016 började vi fylla denna lucka genom att rapportera det uttrycket för en enda transkriptionell coactivator, YAP (Ja-associerade protein) eller dess närbesläktade protein TAZ (transkriptionell aktivator med en PDZ motiv), till terminalt differentierade celler effektivt skapar funktionella, utbyggbart, icke-tumörframkallande, autologa cellpopulationer som är operativt och molekylärt oskiljbara från deras motsvarande vävnadsspecifika SCs1. En puls av ihållande YAP eller TAZ aktivitet för dagarna är tillräcklig för att framkalla utseende själv förnya somatiska SCs. Detta är ett stabilt tillstånd som inte längre beroende av kontinuerlig transgenens uttryck, eftersom det kan överföras genom cell generationer utan vidare uttryck för ektopisk YAP/TAZ1. Protokollet presenteras här Detaljer förfarandet används för att generera de novo epitelial stem-/ stamceller i bröstkörteln och bukspottkörtel, start från differentierade cellerna i dessa vävnader. Detta förfarande fyller en svart låda i nuvarande omprogrammering/transdifferentiation arena. Viktigaste insatser i dessa riktningar har verkligen hittills centrerad på cell övergången till tillståndet inducerade pluripotenta stamceller (iPSC), följt av omvandlingen av dessa embryonala och pluripotenta SCs in mer differentierade celler. IPSCs är dock tumörframkallande en gång infördes i vuxna vävnader, att öka behovet av att utveckla protokoll för deras kompletta och effektiva differentiering2. Men kommer denna differentiering steg, även när det är möjligt till priset av långsiktiga utbyggnad, självorganisering och orgel återinsättning potentialer. Dessa är viktiga attribut för orgel regenerering som i själva verket är typiska bara av endogena vävnadsspecifika SCs och för närvarande beskrivs YAP-inducerad SCs (ySCs). På samma sätt differentierade direkt transdifferentiation av en celltyp till en annan med hjälp av cocktails av olika transkription faktorer också generera celler som saknar grundläggande proliferativ och stemness potentiella3.
Förfarandet beskrivs här tar också nytta av den nyligen införda organoid tekniken, som endogena SCs kan utvidgas och differentierade ex vivo4. YAP-inducerad SCs kan generera organoid-bilda SCs även i experimentell, biologiska eller sjukdom förhållanden där endogena SCs inte är närvarande. Vi vill påpeka att typ av cell plasticitet förmedlade av YAP på skillnaden med andra omplanering förfaranden, kan motsvara den enda formen av reversion till SC-liknande status som förekommer i levande vävnader. Återlåsning av SC-liknande egenskaper har förknippats med vävnad reparera eller onkogena aktiveringen5. Även om dispensable för homeostas av flera vuxna vävnader, är YAP och/eller TAZ absolut nödvändigt för regenerering, tumörtillväxt och expansion av somatiska SCs i vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">10 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:123px;">Rays</td>
			<td style="width:112px;">10LC</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm&#160; cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">15 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430052</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">24-well ultra low attachment plates</td>
			<td style="width:123px;">Costar</td>
			<td style="width:112px;">3473</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">40 mm cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:112px;">352340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">48-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353078</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">50 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430290</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">6-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353046</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">12634028</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPE</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Collagenase, type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018029</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">1705-041</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:123px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:112px;">0503</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">11320033</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">DMSO</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">D2650</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DnaseI</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:112px;">11284932001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">E5134</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FACS tubes (with strainer caps)</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:112px;">352235</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">118208</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#19780&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-EGFP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84041</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-MCS</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84008</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-wtYAP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84009</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:481px;">FUW-tetO-YAPS94A</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84010</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">35050061</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">24020117</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">H3149&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15630-056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human R-Spondin1 (His Tag)</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>11083-H08H-5</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS-X</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab7800&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-8 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab14053&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">&#160;25030081</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">51-9003632</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#174; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0402</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &#248; 94)</td>
			<td style="width:123px;">ROLL</td>
			<td style="width:112px;">18248</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 10x</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM4004XL</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Hamster Anti-Mouse CD61</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">553347</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">551129</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">102222</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I (coating)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">122-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I for 3D culture</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine FGF basic (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td style="width:112px;">450-33</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris BASE&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0,05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waymouth medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31220023</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

Här presenterar vi protokoll för att isolera primära differentierade celler och slå dem i stammen/stamceller (SCs) av samma härstamning av övergående uttryck av transkriptionsfaktor YAP. Med den här metoden omvandlas luminala differentierade (LD) celler från mus mjölkkörtlar till celler som uppvisar molekylära och funktionella egenskaper mjölkkörtlar SCs. YAP också vänder fullt differentierade pankreas exokrina celler i bukspottskörteln kanalen-liknande stamfäder. Likaså att kroppsegna, naturliga SCs, kan YAP-inducerad stamceller-liknande celler (”ySCs”) så småningom utökas som organoid kulturer lång sikt in vitro utan ytterligare behov av ektopisk YAP/TAZ, som ySCs är begåvad med en ärftlig själv förnya SC-liknande tillstånd.
Omplanering proceduren presenteras här erbjuder möjligheten att generera och expandera in vitro- stamceller av olika vävnad källor från differentierade celler. Enkel utbyggnad av somatiska celler ex vivo har konsekvenser för regenerativ medicin, för förståelse mekanismer tumör insättande och, mer generellt, för cell- och utvecklingsbiologi studier.

Generation av yMaSCs En översikt över experimentella strategin att omprogrammera primära mjölkkörtlar LD celler av övergående uttryck av YAP presenteras i figur 1A. Primära mjölkkörtlar LD epitelceller renas av lysrör-aktiverad cell sortering13. Figur 1B representerar en typisk sortering procedur att få tre skilda subpopulationer: basala celler (EpCAMlågCD49fhögCD61–), luminala stamceller (LP) celler (EpCAMhögCD49flågaCD61+ ) och LD celler (EpCAMhögCD49flågaCD61–). Försiktig gating av de tre subpopulationsna är nödvändigt att isolera en ren beredning av LD celler, som är fullt differentierade och helt tillväxt arresterade när seedade i bröstkörteln kolonibildande villkor (se figur 1 c, vänster panel). Omvänt, när induceras att uttrycka exogena YAP, LD celler börjar frodas bildar lätt igenkännliga tät epitelial kolonier i 5% basalmembranet matrix suspension kulturer (figur 1 c). Effektiviteten i omprogrammering, intygas omkring 3% för en typisk experiment, kan vara poängsätts genom att räkna antalet kolonier över antalet enstaka celler ursprungligen seedade i basalmembranet matrix suspension kulturer (figur 1 d). Omstyrda luminala celler (yMaSCs) sedan kan passagen till 100% basalmembranet matrix organoid odlingsbetingelser (se scheme i figur 1A), självorganiserande i komplexa organoid-liknande strukturer som utvecklas kring flera lumen och Visa anmärkningsvärd självförnyelse förmåga även i frånvaro av doxycyklin (dvs. i avsaknad av transgena YAP uttryck) (figur 1E). Histologiskt, yMaSC-derived organoids visar en basala lagret (K14 positiv), inför matrisen basalmembranet rekonstitueras ECM och ett luminala lager (K8 positiv), inför lumen-liknande håligheter inom organoid (figur 1F). Denna arkitektur är omöjlig att skilja från det av organoids som bildas av infödda MaSCs (figur 1F).
Generation av yDucts En översikt över experimentella strategin att omprogrammera primära bukspottskörteln acini av övergående uttryck av YAP presenteras i figur 2A. Hela acinar kluster är isolerad från huvuddelen av bukspottskörteln vävnad genom en kombination av milda dissociation och storlek utslagning genom filtrering. En typisk beredning presenteras i figur 2B. Efter isolering, ska acinar cell kluster visas som en suspension av exokrina acinar enheter av homogen storlek, med ingen förorening av endokrina Langerhanska öar eller fragment av pankreas duktal trädet och minimal dissociation att enstaka celler. Kontaminering av endokrina holmar eller duktal fragment är ett tecken på bristfällig selektiv filtrering (steg 2.1.10), möjligen på grund av hård hantering; oönskade dissociation av acinar kluster att enstaka celler kan bero på överdriven kollagenas behandling eller obuffrat aktivitet av proteolytiska enzymer släpptes av vävnad, som kan stävjas genom ytterligare SBTI behandling.
En typisk acinar omplanering experiment presenteras i figur 2 c; inom 5-7 dagar av kultur i 3D kollagen-jag bygger hydrogel i närvaro av doxycyklin, bukspottskörteln acini härrör från R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A möss lätt förvandlas till kanal-liknande kluster (att vi heter yDucts), består av en tunn enskiktslager av epitelceller som föröka sig runt en expanderande central hålighet. Den omprogrammering effektivitet, vilket är cirka 70% för en typisk experiment, kan lätt mätas genom poängsättning antalet kanal-liknande kluster över det totala antalet seedade acini (figur 2D). Den negativa kontrollen celler, det vill säga R26-rtTAM2 / + celler eller R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A celler kvar utan doxycyklin, alltid förbli som efter mitotiska acinar kluster i dessa odlingsbetingelser, som tidigare rapporterats1 ,14,15. Omprogrammerade yDucts kan sedan vara passaged på enstaka cellnivå i Matrigel-baserade organoid kultur villkorar16 (se scheme i figur 2A), visar anmärkningsvärd självförnyelse förmåga även i frånvaro av doxycyklin (dvs. i avsaknad av transgena YAP uttryck) (figur 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figur 1: Isolering av primära mjölkkörtlar LD celler och induktion av mjölkkörtlar stamceller. (A) schematisk representation av experimentella förfarandet antogs för att omprogrammera primära mjölkkörtlar LD celler. (B) representant FACS-tomter som illustrerar en typisk sortering förfarande att rena LD celler. i) dissocierade celler är gated enligt framåt och side scatter för levande celler (P1, blå); (II) befolkningen P1 är sedan ytterligare gated enligt dess Lin profil: subpopulationen av härstamning-negativa celler (P2; grå) väljs, exklusive härstamning-positiv hematopoetiska celler; (III) befolkningen P2 separeras därefter till en EpCAMhög (P3; gul + grön) och en EpCAMlåg (P6, röd) delpopulationer. IV) P3 och P6 är sedan ytterligare gated enligt deras CD61/CD49f-profilen in i tre undergrupper: EpCAMlågCD49fhögCD61– basala celler (P7; röd), EpCAMhögCD49flågaCD61+ LP celler (P8; gul) och EpCAMhögCD49flågaCD61– LD celler (P9; grön). (C) bilder är belysande för LD celler, som smittats med de angivna konstruktioner, förmåga att bilda mjölkkörtlar kolonier 15 dagar efter sådd i mjölkkörtlar kolonin medium. YAP-uttryckande celler förvandlas till kolonibildande celler, medan negativa kontrollen celler (andra-infekterade) återstår endast som tillväxt-greps enstaka celler. Skalstapeln = 50 μm. (D) kvantifiering av de kolonibildande förmåga i angivna celler, som i (C). Data presenteras som medelvärdet + s.d. och är representativa för fem oberoende experiment, var och en med sex tekniska replikat. (E) representativ bild av YAP-omprogrammeras mjölkkörtlar stamceller-liknande celler (yMaSCs) efter 12 dagar i organoid odlingsbetingelser i färska tredimensionella 100% basalmembranet matrix hydrogel i avsaknad av doxycyklin. Skalstapeln = 100 μm. (F) representativa immunofluorescens bilder för den basala markören K14 (grön) och den luminala markören K8 (röd) av organoids härrör från de angivna cellerna, efter 12 dagar i organoid odlingsbetingelser. Skalstapeln = 10 μm. Denna siffra är reproducerade från Panciera et al., 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figur 2 : Isolering av primära bukspottskörteln acinar celler och induktion av bukspottskörteln stamfäder. (A) schematisk representation av experimentella förfarandet antogs för att omprogrammera primära pankreas exokrina acinar celler. (B) representativ bild av primära bukspottskörteln acini strax efter förfarandet isolering (steg 2.1.14). Acinar preparatet ska visas som en homogen suspension av acinar kluster, med minimal förekomst av enstaka celler. Skalstapeln = 400 μm. (C) representativa bilder av primära bukspottskörteln acini härrör från R26-rtTAM2 (övre paneler)eller R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (lägre paneler) möss och odlade i 3-D kollagen jag-baserat hydrogel i 5 dagar med eller utan Doxycyklin (doxy), som anges. Bara konvertera YAP-uttryckande primära acini celler växer som cysta-liknande organoid efter doxycyklin tillägg. Skala barer = 70 μm. (D) kvantifiering av bukspottskörteln acini förmåga att bilda duktal organoids på transgena YAP överuttryck som i (C). Data presenteras som medelvärdet + s.d. och är representativa för fem oberoende experiment, som utförs med fyra tekniska replikat. (E) representativ bild av YAP-reprogramed duktal-liknande celler (yDucts) efter tre passager i färska tredimensionella 100% basalmembranet matrix hydrogel i avsaknad av doxycyklin. Skalstapeln = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolering av primära mjölkkörtlar celler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 + kelat lösning</td>
			<td>Förvaras vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagen I beläggning lösning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ättiksyra 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat Tail kollagen (beläggning)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase lösning</td>
			<td>Förvaras vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dissociation Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidas stamlösning</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stamlösning kollagenas jag</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemolytisk lösning</td>
			<td>Förvaras vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl lösning</td>
			<td>1 delar</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20,6 HB</td>
			<td>9 delar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Justera pH-värdet till 7,2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Förvaras vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidas stamlösning</td>
			<td>Filtrera 0,2 µm, förvaras vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidas från nötkreatur testiklarna (pulver)</td>
			<td>2 000 E/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfosfat buffert 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl lösning</td>
			<td>Butik på T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Justera pH till 7,65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sortering lösning</td>
			<td>Filtrera 0,2 µm, förvaras vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tvätta Medium #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tvätta Medium #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mjölkkörtlar 2D odlingsmedium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>murina bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murina EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Induktion och Passaging av yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mjölkkörtlar kolonin Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (Lägg omedelbart före sådd)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>murina bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murina EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mjölkkörtlar Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avancerade DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>mänsklig skalle</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murina bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murina EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Generation av yMaSCs. Sammansättningen av alla olika odlingsmedier och lösningar som krävs för isolering av primära mjölkkörtlar LD celler och induktion av yMaSCs (avsnitt 1)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolering av primära bukspottskörteln acini</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar odlingsmedium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexametason</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth's Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar tvätta Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar återhämtning Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar odlingsmedium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagenas jag lösning A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar tvätta Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stamlösning kollagenas jag</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Förvaras vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stamlösning kollagenas jag</td>
			<td>Förvaras vid-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenas, typ jag (pulver)</td>
			<td>6 000 E/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passaging av bukspottskörteln organoids</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagenas jag lösning B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stamlösning kollagenas jag</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bukspottskörteln Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avancerade DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrin</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>mänskliga FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>mänsklig skalle</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murina EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetylcystein</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nikotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penna/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Generation av yDucts. Sammansättningen av alla olika odlingsmedier och lösningar som krävs för isolering av primära acinar celler och induktion och passaging av yDucts (avsnitt 2)

Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Tillgänglighet av somatiska SCs är avgörande för regenerativ medicin, sjukdom modellering och att få inblick i SC boenden. Presenterar här vi experimentella strategier att programmera om, in vitro, åtskillnad mellan vuxna celler till deras motsvarande utbyggbart vävnadsspecifika stam/stamceller av övergående uttryck för den enda transkriptionell samtidig aktivatorn YAP.

De Novo Generation av somatiska stamceller av YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Generation of Human CD40-activated B cells

Generering av Human CD40-aktiverade B-celler

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera humana med Stemgent mänskliga TF lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Analys av pluripotenta stamceller genom att använda kryosnitt av Embryoid organ

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein visdom: En Workbench för<em&gt; I silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design av biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...