Name: de novo generation of somatic stem cells by yap/taz
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

F. Camargo tetO YAPS127A farelerhediye için teşekkür ederim; R26-rtTAM2 fareler (stok #006965) Jackson laboratuardan satın. Chiara Frasson ve Giuseppe Basso FACS yordamlar ile yardım için teşekkür. Bu eser AIRC özel Program moleküler klinik Onkoloji '' mille başına 5'' tarafından desteklenen ve bir AIRC PI-Grant S.P için ve epigenetik amiral gemisi projesi CNR-Miur tarafından S.P. için verir Bu proje Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (hibe sözleşmesi DENOVOSTEM No 670126) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden fon aldı.

<ol>
	<li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage.">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration.">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281 (2014).</li><li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation.">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li><li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program.">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li><li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis.">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li><li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration.">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+of+mutant+KRAS,+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).</li><li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+at+the+Roots+of+Cancer.">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li><li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response.">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates.">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li><li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia.">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li><li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage.">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li><li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration.">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li><li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration.">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration.">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li><li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease.">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Burada YAP, geçici ifade tarafından daha önce1bildirildiği gibi ölümcül ayrıştırılan ex vivo epitel hücreleri farklı dokuların onların karşılık gelen doku özgü progenitör hücreler (ya da ySCs) yeniden programlamak için protokolleri mevcut. Biz iki yordam ayrıntılı: bir lentiviral Vektörler ve viral enfeksiyon önler ve alan avantaj transgenik YAP ifade ikinci bir FACS saf hücrelerinin yeniden programlama sağlar. Her iletişim kuralı izole etmek için etkili bir strateji sunar ve farklı hücrelerde de novo somatik doku özgü Genişletilebilir kök hücreleri (bkz: üreten gen ekspresyonu YAP kültür birincil farklılaşmış hücreler ve eksojen zorlamak için bir strateji düzenleri rakamlar 1A ve 2A).
Burada etkin bir şekilde sunulan yalıtım stratejileri farklılaştırılmış hücrelerin saf bir nüfus ayrı bir şekilde negatif kontrol örnekleri (rakamlar 1 c ve 2 C) üzerinden herhangi bir çıkıntı hiç tespit ettik Aslında gösterdiği gibi gösterdi.
Bu çalışmada birincil meme LD hücrelerinin yeniden programlama için kullanılan lentiviral vektörleridir Doksisiklin transgene ifade sıkı bir kontrol imkanı sunan indüklenebilir; Bu açmak için izin verir ve eksojen YAP ifade eder. Bu verimlilik yeniden programlama açısından zararlı olabilir gibi özellikle dikkat aşırı bir viral titresi kullanımı kaçınarak yer almalıdır. Birincil acinar hücreleri söz konusu olduğunda, bir YAP-bağımlı ile en az manipülasyonlar yeniden programlama elde etmek için tam transgenik bir yaklaşım için açık. İzole acinar kümeleri pek müsait lentiviral enfeksiyon ve çok kırılgan olduğu gibi bu ikinci strateji de birincil pankreas acini için özellikle uygundur. İstihdam transgenik strateji Doksisiklin bağımlı lentiviral vektörler gen ekspresyonu sıkı kontrolü için aynı avantajı sunuyor. Ayrıca, birincil pankreas acini ile istismar transgenik strateji viral kaynaklı meme LD hücrelerinin yeniden programlama için göre bir çok daha yüksek programlama verimlilik avantajı taşımaktadır. Hücrelere farklı dokular elde ilişkili farklı iç plastisite pankreas yeniden programlama daha yüksek oranda daha yüksek verim ilişkili tüm üniforma ve özerk YAP ifade için ifade türetilen explanted hücreleri. Özellikle, eksojen YAP artık ySCs (yMaSC kolonileri ve yDucts), bir nesil sonra kendi kendini yenileme kapasitesi etkilemeden gerekli olduğunu göstermiştir. Bunun nedeni ySCs endojen YAP/TAZ yeniden etkinleştirin ve eksojen YAP1adet açık olduğunda onları öz-yenileme için kullanın.
YSCs gerçekten de ortaya farklılaştırılmış hücrelerden programlama deneylerimiz ile genetik soy izleme doğrulamaları1menşe hücre kontrol ederek kavramı geçerliliği.
Geniş karakterizasyonuySCs gösterir YAP kaynaklı yeniden programlama normal somatik SCs1 ben oluşturur) transcriptomic düzeyinde ySCs ile yerli SCs; büyük programların çakışmasını görüntülemek. II) ySCs farklılaşma potansiyeli görüntülemek ve her zaman onların doku kökenli kimlik için sınırlı bir multilineage döl oluşturabilir; III) sigara dönüştürülmüş ySCs ve tumorigenic zaman içinde vivonakledilmektedir.
Burada da korumak ve kültürde genişletmek için yordamlar açıklar yMaSCs ve yDucts organoids olarak % 100 membran matris hydrogels içinde gömülü. Bu koşullar için kendi kendine organizasyon olanak verir stemness özellikleri kültürde uzun vadeli bakım sağlamak üç boyutlu organoids içine ySCs nüfus aşağı akım analizleri ve uygulamalar için diledikleri kaynaklanıyor bunlar genişletmek için etkinleştirme. Bilinmeyen nedenlerden dolayı yMaSC alamadı yerleştirerek organoids enfekte LD hücreleri organoid kültür koşullarda doğrudan plastik doku kültürü plaka; Doksisiklin tedavi sonrası 7 gün başka bir deyişle, ara büyüme meme koloniyi koşulları temel adımdır. Bizim ellerde bile yerli MaSCs organoid kültür passaging önce meme koloniyi koşullar gerektirir. Ayrıca, biz birincil kolonileri tek hücrelere dissociating önlemek, ancak oldukça sağlam koloniler organoid kültür koşullar aktarmak en verimli organoid sonucu elde edilir.
Organoid kültür koşulları da şartıyla organoids hücre ayrılma dondurma azot banyo önce kaçınarak onların matrisler kurtarıldı ySCs, cryopreserve imkanı veren avantajı ayı.
Sunulan yordam yeniden programlama YAP farklı farklı hücre tipleri farklı yetişkin dokulardan (biz-si olmak sınav meme, pankreas ve nöronal hücre kullanarak) karşılık gelen doku özgü kök hücreler türetilmiş dönüştürebilirsiniz1. İPSCs veya diğer programlama çabaları farklılık, YAP/indüklenen SCs doku kökenli anıları koruyabilirsiniz. Dikkat, kök gibi özelliklerle donatılmış hücrelere somatik hücre de-farklılaşma hücre kader plastisite tek biçimidir ve yeniden programlama örneğin sonra doku hasarı ve5,17 şifa yara desteklemek için içinde vivo gözlenen , 18 , 19 , 20. bu önemli YAP ve TAZ için normal homeostazı büyük ölçüde gereksiz ama birden fazla doku11,21doku onarımı için çok önemli değil. Sürekli burada açıklanan programlama adımları fizyolojik fonksiyonu ile YAP/TAZ son zamanlarda gösterilmiştir bir dönüşüm yetişkin bağırsak hücrelerinin neden olarak bağırsak rejenerasyon Ülseratif Kolit hastalarının fare modellerinde gerekli için fetal gut19özelliklerini görüntüler tamir epitel. YAP yeniden programlama böylece geçerli indüklenen hücre plastisite stratejileri sağlayarak kuruluşlarınızdaki defa içinde vitroyakalamak için zorlu bir devlet, somatik kök hücre üretmek için genişler. Bu yaklaşım, aynı zamanda insan kaynaklı hücrelere genişletilmiş geniş ilgi somatik stemness devletin çalışma rejeneratif tıp uygulamalarından olan ve somatik genişlemesi için kök hücreleri vitro.

Doku özel somatik kök hücreleri (SCs) yaralanma sonra doku yenileme ve onarım için kritik öneme sahiptir. Kolayca ayırmak ve unlimitedly ex vivo somatik SCs temsil SC uygulamalarında temel araştırma ve hastalık modelleme yanı sıra potansiyel rejeneratif tedaviler için kritik bir sorunu genişletin imkanı. Bu yönde ilerleme ancak, çeşitli epitelyal organları içinde vitroSC durumunu yakalayan zorluk tarafından sınırlıdır. Gerçekten de, birçok yetişkin dokularda ikamet SCs var veya kullanıma hazır olur olmaz veya kendi numarası ve rejeneratif potansiyel ya da yaşlanma hastalığı koşullar tarafından aşınmış olabilir. Bu ifade, tek bir transkripsiyon coactivator bildirerek bu boşluğu doldurmak başladık 2016 yılında YAP (Evet ilişkili protein) veya onun yakından ilişkili protein TAZ (transkripsiyon harekete geçirmek PDZ motifi ile), ölümcül farklılaşmış hücreler verimli bir şekilde onların karşılık gelen doku özgü SCs1operasyonel ve tatlı ayırt edilemez işlev, genişletilebilir, Sigara tumorigenic, Otolog hücre popülasyonlarının oluşturur. Bir darbe YAP sürekli veya TAZ birkaç gündür somatik SCs kendini sürekli yenileyen görünümü ikna etmek yeterli bir faaliyettir. Bu gibi daha fazla ifade Ektopik YAP/TAZ1olmadan cep nesilden bulaşabilir artık sürekli transgene ifade üzerinde bağımlı değil istikrarlı bir durumdur. Protokol burada yordam de novo epitel kök/progenitor hücreler meme bezi ve pankreas, bu dokuların farklılaştırılmış hücrelerden başlangıç üretmek için kullanılan ayrıntıları sundu. Bu yordamı geçerli yeniden programlama/transdifferentiation arenada bir kara kutu doldurur. Bu yönde ana çabaları gerçekten defa bu embriyonik dönüşüm tarafından takip bir İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC) durumuna hücre geçiş merkezli ve pluripotent SCs içine daha hücreleri ayrıştırılan. Ancak, iPSCs bir kez onların tam ve verimli farklılaşması2protokollerde geliştirme ihtiyacı yükselterek yetişkin dokularda ortaya tumorigenic. Ancak, bu farklılaşma adımı bile mümkün olduğunda, uzun vadeli genişletilebilirlik, kendi kendine organizasyon ve organ repopulation potansiyelleri bedeli vardır. Aslında tipik sadece endojen doku özgü SCs ve şu anda açıklanan YAP kaynaklı SCs (ySCs) temel öznitelikleri organ rejenerasyon için bunlar. Benzer şekilde, doğrudan transdifferentiation bir hücre türü kokteyller ve çeşitli transkripsiyon faktörleri de oluşturmak kullanarak başka bir temel proliferatif stemness potansiyel ve3eksikliği hücreleri ayrıştırılan.
Burada açıklanan yordamı da endojen SCs genişletilebilir ve ex vivo4farklı son zamanlarda tanıtılan organoid teknoloji yararlanır. SCs YAP kaynaklı endojen SCs mevcut değildir bile deneysel, biyolojik ya da hastalık koşullarında organoid oluşturan SCs oluşturabilir. Diğer programlama yordamları ile farkı, reversion canlı dokularda oluşan bir SC benzeri durum için sadece formu YAP tarafından öğretilir hücre plastisite tür karşılık, notu istiyorum. Reacquisition SC gibi özelliklerin doku onarım veya oncogenic harekete geçirmek5ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Birkaç Yetişkin dokuların homeostazı için gereksiz olmasına rağmen YAP ve/veya TAZ kesinlikle yeniden oluşturma işlemi, tümör büyüme ve in vitro1,6,7,8 somatik SCs genişlemesi için gereklidir ,9,10,11,12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">10 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:123px;">Rays</td>
			<td style="width:112px;">10LC</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm&#160; cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">15 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430052</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">24-well ultra low attachment plates</td>
			<td style="width:123px;">Costar</td>
			<td style="width:112px;">3473</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">40 mm cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:112px;">352340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">48-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353078</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">50 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430290</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">6-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353046</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">12634028</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPE</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Collagenase, type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018029</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">1705-041</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:123px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:112px;">0503</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">11320033</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">DMSO</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">D2650</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DnaseI</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:112px;">11284932001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">E5134</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FACS tubes (with strainer caps)</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:112px;">352235</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">118208</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#19780&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-EGFP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84041</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-MCS</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84008</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-wtYAP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84009</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:481px;">FUW-tetO-YAPS94A</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84010</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">35050061</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">24020117</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">H3149&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15630-056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human R-Spondin1 (His Tag)</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>11083-H08H-5</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS-X</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab7800&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-8 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab14053&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">&#160;25030081</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">51-9003632</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#174; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0402</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &#248; 94)</td>
			<td style="width:123px;">ROLL</td>
			<td style="width:112px;">18248</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 10x</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM4004XL</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Hamster Anti-Mouse CD61</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">553347</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">551129</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">102222</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I (coating)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">122-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I for 3D culture</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine FGF basic (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td style="width:112px;">450-33</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris BASE&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0,05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waymouth medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31220023</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

Burada birincil farklılaşmış hücreler ve çevirmek onları içine kök/progenitor hücreler (SCs) transkripsiyon faktörü geçici ifade tarafından aynı soydan YAP izole etmek için protokolleri mevcut. Bu yöntemle, moleküler ve fonksiyonel özelliklerini meme SCs. YAP sorun da tam ayrıştırılan döner pankreas ekzokrin hücrelere Pankreatik kanal benzeri oluşturan hücrelere luminal farklılaştırılmış (LD) hücreler fare meme bezinin dönüştürülür ataları. YSCs kalıtsal bir kendi kendini yenileyerek SC gibi devlet ile donatılmış olan gibi benzer şekilde, endojen, doğal SCs için YAP kaynaklı kök benzeri hücreler ("ySCs") sonunda organoid kültürler uzun vadeli in vitro Ektopik YAP/TAZ, daha fazla ihtiyacı olmadan olarak genişletilebilir.
Burada sunulan programlama yordamı oluşturmak ve vitro progenitör hücre farklılaştırılmış hücrelerden başlayarak çeşitli doku kaynaklarının genişletmek imkanı sunuyor. Somatik hücre ex vivo basit genişlemesi rejeneratif tıp, anlayış mekanizmaları tümör inisiyasyon ve daha fazlası için genel olarak, hücre ve gelişim biyolojisi çalışmaları için etkiler.

YMaSCs nesil Şekil 1A' deneysel strateji birincil meme LD hücreleri YAP geçici ifade tarafından yeniden programlamak için genel bir bakış sunulmaktadır. Birincil meme LD epitel hücreleri floresan aktif hücre tarafından13sıralama saf. Şekil 1B temsil eden üç ayrı altgrupları elde etmek için normal bir sıralama yordama: Bazal hücreler (EpCAMdüşükCD49fyüksekCD61-), Luminal Dede (LP) hücreleri (EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61+ ) ve LD hücreleri (EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61-). Dikkatli üç altgrupları çoğunluğuna LD hücrelerin saf bir hazırlık yalıtmak için önemlidir, bu tam olarak ayırt ve tamamen büyüme koşullara (bakınız şekil 1 cpanel yaptı,) oluşturan meme bezi kolonisinde seribaşı zaman tutuklandı. Tersine, zaman eksojen YAP ifade etmek için indüklenen, kolayca tanınabilir yoğun epitel koloniler halinde % 5 membran matris süspansiyon kültürler (şekil 1 c) oluşturmak üzere Proliferasyona LD hücreleri başlar. Yeniden programlama, verimliliği tespit için tipik bir yaklaşık % 3 deneme, kolonileri başlangıçta membran matris süspansiyon kültürlerde (şekil 1 d) numaralı seribaşı tek hücre sayısı üzerinden sayılması tarafından attı. Programlanmış luminal hücreleri (yMaSCs) o zaman geçit birden fazla Lümen geliştirmek karmaşık organoid benzeri yapılar kendi kendini düzenleme ( şekil 1Adüzeninde) % 100 membran matris organoid kültür koşullara bakınız, içine olabilir ve Doksisiklin (Yani transgenik YAP ifade yokluğunda) yokluğunda bile dikkate değer kendini yenileme yeteneği görüntülemek (şekil 1E). Histolojik olarak, yMaSC elde edilen organoids Bazal tabaka (K14 pozitif) ekran, membran matris karşı karşıya ECM ve Lümen benzeri boşluklar organoid (şekil 1F) içinde karşı karşıya luminal Katmanı (K8 pozitif), yeniden düzenlendi. Bu mimari bu yerel MaSCs (şekil 1F) tarafından kurulan organoids dan ayırt edilemez olduğunu.
YDucts nesil Deneysel strateji birincil pankreas acini YAP geçici ifade tarafından yeniden programlamak için genel bir bakış şekil 2Asunulur. Tüm acinar kümeleri pankreas dokusunun toplu bir arada hafif ayrılma ve boyutu dışlama filtrasyon yoluyla tarafından izole edilmiştir. Tipik bir hazırlık şekil 2Biçinde sunulur. Yalıtım sonra acinar hücre kümeleri yok kirlenme endokrin Langerhans adacıkları veya pankreas duktal ağaç ve tek hücrelere en az ayrılma parçaları ile homojen boyutta ekzokrin acinar birimlerinin bir süspansiyon olarak görünmelidir. Kirlenme endokrin adacıkları veya duktal parçaları eksik Seçici Filtrasyon (Adım 2.1.10), büyük olasılıkla sert işleme nedeniyle bir göstergesidir; Tek Kişilik hücrelere acinar kümelerinin istenmeyen ayrılma aşırı collagenase tedavi veya tamponsuz etkinliğini proteolitik enzimler tarafından ek SBTI tedavi sınırlama doku tarafından yayımlanan nedeniyle olabilir.
Tipik bir acinar programlama deney şekil 2Ciçinde sunulur; 3D kollajen kültüründe 5-7 gün içinde-hidrojel Doksisiklin huzurunda dayalı, pankreas acini R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A fareler kolayca elde açmak kanalı gibi kümeler halinde ( yDuctsadını verdik ki), oluşan ince bir monolayer epitel hücrelerinin genişleyen bir merkez kavite çoğalırlar. Tipik bir deneme için % 70 civarındadır, programlama verimliliği numaralı seribaşı acini (şekil 2B) toplam sayısı üzerinden kanal benzeri küme sayısı puanlama tarafından kolayca ölçülebilir. Negatif kontrol hücreleri, yani R26-rtTAM2 / + Doksisiklin, hücreleri veya R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A hücreleri sola kaçınılmaz kalır daha önce bildirilen bu koşullarda kültür,1 sonrası Mitotik acinar kümeleri ,14,15. Programlanmış yDucts sonra passaged tek hücre düzeyinde Matrigel tabanlı organoid kültür koşulları16 (bkz. şekil 2Adüzeninde) olağanüstü kendini yenileme yeteneği bile Doksisiklin (Yani yokluğunda görüntüleme transgenik YAP ifade yokluğunda) (şekil 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Şekil 1: Birincil meme LD izolasyon hücreler ve meme indüksiyon kök hücre. (A) deneysel işlemin şematik gösterimi kabul birincil meme LD hücreleri yeniden programlamak için. LD hücreleri arındırmak için (B) temsilcisi FACS-araziler tipik bir sıralama yordam gösteren. i) Disosiye hücreleri canlı hücreler (P1; mavi) için ileriye doğru ve yan dağılım göre geçişli II) nüfus P1 sonra daha fazla kapı onun Lin tercihe göre: Lineage pozitif hematopoetik hücrelerin; hariç subpopulation Lineage negatif hücre (P2; gri) seçilir III) nüfus P2 sonra içine bir EpCAMyüksek (P3; sarı + yeşil) ve bir EpCAMdüşük (P6; kırmızı) altgrupları ayrılmaktadır; IV) P3 ve P6 o zaman daha fazla kapı onların CD61/CD49f tercihe göre üç altgrupları: EpCAMdüşükCD49fyüksekCD61- Bazal hücreler (P7; kırmızı), EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61+ LP hücreleri (P8; sarı) ve EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61- LD hücreleri (P9; yeşil). (C) meme kolonileri meme koloniyi ortamda tohum sonra 15 gün oluşturmak için yetenek belirtilen yapıları ile enfekte LD hücrelerinin açıklayıcı görüntülerdir. Sadece YAP ifade hücreleri dönüşte koloni oluşturan hücreleri, (EGFP-enfekte) negatif kontrol hücreleri, ancak kalır tek hücreler olarak büyüme tutuklandı. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (D) miktar yeteneği olduğu gibi (C) belirtilen hücre oluşturan Colony. Verileri ortalama + SD sunulmaktadır ve beş bağımsız deneyler, her altı teknik çoğaltır ile temsilcisi. (E) temsili resim YAP yeniden programlanan meme kök hücre benzeri hücre (yMaSCs) organoid kültür koşullarda taze üç boyutlu % 100 membran matris hidrojel yokluğunda Doksisiklin içine 12 gün sonra. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (F) temsilcisi ayirt görüntüleri için Bazal işaretçiyi K14 (yeşil) ve luminal marker K8 (kırmızı) organoids organoid kültür koşullar içine 12 gün sonra belirtilen hücrelerden türetilmiş. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam Panciera vd., 20161' den yeniden oluşturulur. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Resim 2 : Yalıtım birincil pankreas acinar hücreleri ve pankreas ataları indüksiyon. (A) deneysel işlemin şematik gösterimi kabul birincil pankreas ekzokrin acinar hücreleri yeniden programlamak için. (B) temsilcisi görüntü yalıtım yordamı (Adım 2.1.14) hemen sonra birincil pankreas acini. Acinar hazırlık tek hücreleri en az varlığı ile acinar kümeleri, homojen bir süspansiyon görünmesi gerekir. Ölçek çubuğu 400 mikron =. (C) birincil pankreas acini temsilcisi görüntüleri elde edilen R26-rtTAM2 (üst panelleri)veya R26-rtTAM2; tetO YAPS127A (alt paneller) fareler ve 3-b kolajen kültürlü-5 gün ile ya da ezelî hidrojel dayalı Doksisiklin (şırfıntı) belirtildiği gibi. Yalnızca birincil acini YAP ifade kist benzeri organoid Doksisiklin eklenmesinden sonra büyüyen hücreler için dönüştürün. Ölçek çubukları 70 mikron =. (D) miktar pankreas acini yeteneği transgenik YAP overexpression (C) olduğu gibi üzerine duktal organoids oluşturmak için. Verileri ortalama + SD sunulmaktadır ve dört teknik çoğaltır ile gerçekleştirilen beş bağımsız deneyler temsilcisi. (E) temsili resim YAP reprogramed duktal benzeri hücre (yDucts) üç pasajlar taze üç boyutlu % 100 membran matris hidrojel Doksisiklin yokluğunda sonra. Ölçek çubuğu 130 μm kalınlığında =. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Birincil meme hücre izolasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözüm şelat Ca2 +</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>%0,02 w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollajen ben çözüm kaplama</td>
		</tr>
<tr>
<td>Asetik asit 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sıçan kuyruğu kollajen (kaplama)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase çözüm</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ayrılma orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase hisse senedi çözüm</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemolitik çözüm</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl çözüm</td>
			<td>1 parçalar</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 g/L</td>
			<td>9 parça</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.2 için ayarlamak</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase hisse senedi çözüm</td>
			<td>Filtre 0.2 µm, mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase sığır testisler (toz) üzerinden</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum fosfat tampon 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl çözüm</td>
			<td>T. amb saklayın.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7.1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>7,65 pH ayarlama</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözüm sıralama</td>
			<td>Filtre 0.2 µm, mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Orta #1 yıkama</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Orta #2 yıkama</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meme 2D kültür orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">İndüksiyon ve yMaSCs Passaging</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Meme koloniyi orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (hemen önce tohum ekleyin)</td>
			<td>% 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Meme Organoid orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gelişmiş DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsan kafa</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: yMaSCs nesil. Kompozisyon tüm farklı kültür medya ve yalıtım birincil meme LD hücre ve yMaSCs (Bölüm 1) indüksiyon için gerekli çözümleri
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Birincil pankreas acini yalıtım</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar kültür orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deksametazon</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth'ın orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar yıkama orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar kurtarma orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar kültür orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 30</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase ben çözüm A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar yıkama orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (fosfat tamponlu tuz)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>Mağaza-20 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase, türü ben (toz)</td>
			<td>6000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pankreas organoids passaging</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase ben çözüm B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pankreas Organoid orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gelişmiş DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrin</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>insan FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsan kafa</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nikotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: yDucts nesil. Kompozisyon tüm farklı kültür medya ve yalıtım birincil acinar hücreleri ve indüksiyon ve yDucts (Bölüm 2.) passaging için gerekli çözümleri

Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Rejeneratif tıp için çok önemli olduğunu somatik SCs hastalığı modelleme ve SC özellikleri anlayış kazanmak için. Burada yeniden programlamak için deneysel stratejiler mevcut, içinde vitro, yetişkin hücreler karşılık gelen Genişletilebilir doku özgü kök/progenitor hücreler tek transkripsiyon co aktivatörü YAP geçici ifade tarafından ayrıştırılan.

De Novo Somatik kök hücreleri tarafından YAP/TAZ nesil

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Generation of Human CD40-activated B cells

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embriyoid Kuruluşlar Cryosections kullanarak Pluripotent Kök Hücre Analizi

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein AKIL: A Tezgahı<em&gt; Siliko olarak</em&gt;<em&gt; De novo</emBiyomoleküllerin&gt; Tasarım

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...