Name: detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

Microscopie de tous a été fait au W. M. Keck microscopie Centre avec le soutien de Nathaniel Peters et avec le soutien du prix NIH S10OD016240. S.L.F. est pris en charge par les NIH K08AI119142 et R21AI130281. Nous remercions le Dr Richard Flavell et Dr Brad Cookson pour les souris déficientes en caspase-1/11 et Dr. Brad Cookson pour le partage des équipements et des installations de laboratoire.

Toutes les procédures d’animaux ont été approuvés et effectuées en vertu de l’Université de Washington animalier institutionnel et Comité de l’utilisation de lignes directrices.
1. récolte de moelle osseuse
<ol><li>Retirer le fémur et le tibia de souris de façon aseptique et nettoyer les os à l’aide d’instruments stériles. Les os nettoyés au moyen d’Eagle modifié Dulbecco (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL, L-glutamine + 0,05 mM 2-mercaptoéthanol + sulfate de gentamic...

<ol>
	<li>Jorgensen, I., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptotic+cell+death+defends+against+intracellular+pathogens.">Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens.</a> Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).</li><li>Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+action,+role+in+disease,+and+therapeutics.">Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics.</a> Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+host+responses+during+pyroptosis:+caspase-1-dependent+lysosome+exocytosis+and+inflammatory+cytokine+maturation.">Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation.</a> J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death.">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li><li>Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NLRP3+inflammasome+activation.">Mechanism of NLRP3 inflammasome activation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).</li><li>Juliana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transcriptional+priming+and+deubiquitination+regulate+NLRP3+inflammasome+activation.">Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation.</a> J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).</li><li>Py, B. F., Kim, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+assembly,+regulation+and+signalling.">Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).</li><li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC,+a+novel+22-kDa+protein,+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells.">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC+is+essential+for+LPS-induced+activation+of+procaspase-1+independently+of+TLR-associated+signal+adaptor+molecules.">ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules.</a> Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).</li><li>Miao, E. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pore-Forming+Protein+Gasdermin+D+Regulates+Interleukin-1+Secretion+from+Living+Macrophages.">The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages.</a> Immunity. , (2017).</li></ol>

Dans ce manuscrit, nous présentons deux techniques pour examiner l’inflammasome activation et la conséquence de l’activation de la caspase-1 après stimulation NLRP3 dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse murines. La première technique permet au chercheur de déterminer le niveau d’activation de la caspase-1 sur une base cellulaire à l’aide de la journaliste fluorescent FAM-YVAD-FMK. Ce journaliste est très spécifique pour la famille de caspase-1 d’enzymes, de liaison, comme en témoigne l’...

L’inflammation induite par l’inflammasome est un élément essentiel de la défense contre les organismes pathogènes1, mais elle sous-tend également l’étiologie des nombreuses maladies2. La réponse inflammatoire à un large éventail d’infections est déclenchée par la détection cytosolique de profils moléculaires pathogènes associés (PAMPs) ou dommages associated molecular patterns (DAMPs). Récepteurs de reconnaissance de modèle (PRR), y compris les membres de la famille des récepteurs de type NOD (NLR), oligomerize sur la détection de ces PAMPs et DAMPs. Cela déclenche la formation d’un complexe de plusieurs protéine appelé l’inflammasome, qui contient de la PRR, la protéine adaptatrice associées à l’apoptose speck-protéine contenant un domaine de caspase-recrutement C-terminal (carte) (ASC) et la Pro-forme de Caspase-13,4. Ce complexe permet de proximité induite par l’activation automatique de la caspase-1. Caspase-1 active puis conduit à une série d’événements qui sont caractéristiques de la pyroptosis de voie de mort cellulaire inflammatoire. Ces événements incluent : le clivage et la libération des cytokines inflammatoires IL-1β et IL-18, exocytose lysosome avec libération du contenu lysosomial dans l’espace extracellulaire, condensation nucléaire et clivage gasdermin D. Le domaine N-terminal libéré de gasdermin D insère dans la membrane plasmique, formant des pores qui causent la rupture de la membrane plasmique et la libération des matières incendiaires, outre emportant une niche protectrice pour pathogène réplication5, 6 , 7.
Ici, nous nous concentrons sur l’inflammasome NLRP3 bien étudié. L’activation de l’inflammasome NLRP3 s’effectue par un processus de deux étapes8. La première étape de « l’amorçage » se produit grâce à la reconnaissance par les récepteurs Toll-like (TLR) d’un produit microbien. C’est répliquée en laboratoire en utilisant des LPS pour stimuler le TLR4. Cette stimulation augmente NLRP3 et pro-IL-1β, par le biais de signalisation NF-kB. D’amorçage en outre licenses NLRP3 grâce à des mécanismes non-transcription en incitant ses déubiquitination9,10 phosphorylation ou déphosphorylation des résidus spécifiques11,12.
Le deuxième signal d’activation NLRP3 semble impliquer des facteurs mitochondries, espèces réactives de l’oxygène, efflux de potassium et le calcium de signalisation, un processus unificateur pour activation NLRP3 demeure insaisissable8. NLRP3 activés oligomerizes grâce à des interactions entre ses domaines NACHT et recrute ASC via la liaison des domaines pyrine (PYD)13. Dans chaque cellule, ces complexes macromoléculaires forment un seul foyer visible au microscope. NCP a été initialement identifiée comme une protéine de 22 KDa qui forme un « grain » au cours de l’apoptose des cellules leucémiques humaines et nommée associées à l’apoptose speck-protéine contenant une carte14. Il a été déterminé plus tard que l’ASC recrute pro-caspase-1 par le biais de l’interaction de la carte de l’ASC avec la carte de la pro-caspase-1, formant l' inflammasome15.
Pas tous NLRs nécessitent la présence d’ASC d’induire l’activation de la caspase-1. Contrairement à NLRP3, NLRC4 et NLRP1b ont des domaines de carte et peuvent recruter directement de pro-caspase-1 via des interactions de carte-carte d’induire l’activation de la caspase-1. En l’absence d’ASC, caspase-1 active reste diffus dans le cytosol et ne forme pas un seul foyer. Cet actif diffuse caspase-1 est suffisante pour induire la mort des cellules pyroptotic, mais ne peut pas traiter les pro-IL-1β13,16.
Dans ce manuscrit, nous traiterons deux façons d’évaluer inflammasome activation. Le premier utilise l’activité fluorescente probe, FAM-YVAD-FMK, qui lie la famille caspase-1 des protéases. Cette famille comprend caspase-1, mais aussi souris caspase-11 et caspase-4 humain et caspase-5. À l’aide de macrophages de souris déficientes en caspase-1/11 dans toutes les expériences, la spécificité de cette sonde sera abordée. Cette méthode peut être combinée avec l’anticorps étiquetage des composants inflammasome, que nous décrirons également. Visualisation microscopique permet l’identification des cellules individuelles contenant des actifs caspase-1 et CSA oligomerized. En utilisant cette méthode, les chercheurs seront en mesure de déterminer où dans la cascade de formation inflammasome leurs manipulations de la cellule hôte ou de l’organisme pathogène à l’étude ont un effet. Par exemple, on peut distinguer une intervention donnée empêche le recrutement de l’ASC à la NLRP3 complexes ou cible le recrutement et l’activation de la caspase-117. Examen des résultats de l’activation de la caspase-1 comme la sécrétion d’IL-1β ne serait pas en mesure de faire la distinction entre ces deux possibilités. En outre, la sécrétion d’IL-1β pourrait être modifiée sans altérer les cellules permet d’activer la caspase-1 et subir de mort cellulaire pyroptotic16.
La deuxième méthode permet de mesurer la libération de la lactate déshydrogénase (LDH) dans la cellule surnageante, qui se produit lors de la lyse pyroptotic macrophage après l’activation de la caspase-1 tel que décrit ci-dessus. Cette deuxième méthode est une approche axée sur la population, la libération de LDH dans l’ensemble du bien est mesurée. Cette approche simple permet l’analyse rapide (30 min de temps d’incubation) d’échantillons pour déterminer s’il y a la mort cellulaire médiée par caspase-1 et peut être réalisée dans un format de plaque à 96 puits.
Ces méthodes sont complémentaires, chacune avec différents avantages et les deux se prêtent facilement à des modifications. Par exemple, traitement des macrophages avec ciblée de faible poids moléculaire des composés avant inflammasome stimulation permet d’enquêter sur le rôle de certain protéines peuvent avoir sur le contrôle des réactions inflammatoires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-MEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>For growing L929 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCRC clone 929 (L929)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer.&#160; Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR-G1780</td>
			<td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-YVAD-FMK</td>
			<td>Immunocytochemistry Technologies</td>
			<td>98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Heat inactivated at 55&#176;C for 50 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p36934</td>
			<td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse ALEXA555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21051024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>far-red fluorescent nucleic acid stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratoy</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-1/11-/- mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>016621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8X Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td>
			<td>List Biologicals</td>
			<td>434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ASC clone 2EI-7</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>04-417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercapto-ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax M3 plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>5000414</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes sont des plates-formes signalisation immunitaires innés qui sont nécessaires pour la réussite du contrôle de nombreux germes pathogènes, mais aussi promouvoir inflammatoires et maladies auto-inflammatoires. Inflammasomes sont activées par des récepteurs de reconnaissance modèle cytosolique, y compris les membres de la famille des récepteurs (NLR) comme clin de œil. Ces récepteurs oligomerize dès la détection des stimuli microbiennes ou associés aux dommages. Recrutement de la protéine adaptatrice ASC forme un complexe, inflammasome visible au microscope, qui active la caspase-1 à proximité induite par l’activation automatique. Suite à l’activation, caspase-1 Clive pro-IL-1β et pro-IL-18, conduisant à l’activation et la sécrétion de ces cytokines pro-inflammatoires. Caspase-1 intervient aussi dans la forme inflammatoire de la mort cellulaire appelée pyroptosis, qui comprend la perte de la lyse de l’intégrité et la pile à membrane. Caspase-1 Clive gasdermin D, libérant le fragment N-terminal qui forme des pores de la membrane plasmique, conduisant à la lyse osmotique.
In vitro, l’activation de la caspase-1 peut être déterminé par marquage des macrophages dérivés de la moelle osseuse avec la sonde de l’activité de la caspase-1 FAM-YVAD-FMK et par marquage des cellules avec des anticorps dirigés contre la protéine adaptatrice ASC. Cette technique permet l’identification d’inflammasome formation et l’activation de la caspase-1 dans des cellules individuelles à l’aide de la microscopie de fluorescence. Pyroptotic la mort cellulaire peut être détectée en mesurant la libération de lactate-déshydrogénase cytosolique dans le milieu. Cette procédure est simple, rentable et effectué dans un format de plaque à 96 puits, permettant l’adaptation pour le dépistage. Dans ce manuscrit, nous montrons que l’activation de l’inflammasome NLRP3 par nigéricine mène à la co-localisation de la protéine adaptatrice ASC et active caspase-1, menant à pyroptosis.

Pour détecter l’activation de la caspase-1 suite à l’exposition aux nigéricine, les cellules ont été traitées comme décrit dans la section protocole. Nous avons combiné les FAM-YVAD-FMK et ASC anticorps étiquetage afin de montrer que NCP et caspase-1 active co localiser après l’activation induite par NLRP3 inflammasome. Figure 1 a montre que wild type macrophages exposés à 5 μM nigéricine ayant formation d’un foyer de l’ASC dans la ré...

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Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Nous décrivons la détection d’activation inflammasome NLRP3 sur base cellulaire à l’aide de la microscopie en fluorescence et coloration pour active caspase-1 et l’adaptateur, ASC. Un test de libération de lactate déshydrogénase est présenté afin de détecter la lyse pyroptotic sur une base de population. Ces techniques peuvent être adaptés afin d’étudier plusieurs aspects de la biologie inflammasome.

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

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Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

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Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des cellules dans la moelle osseuse murine

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolement et activation de murins Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...