Name: detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

Alle Mikroskopie erfolgte in der W. M. Keck Mikroskopie Mitte mit Unterstützung von Nathaniel Peters und mit Unterstützung des NIH Award S10OD016240. S.L.F. wird von NIH K08AI119142 und R21AI130281 unterstützt. Wir danken Dr. Richard Flavell und Dr. Brad Cookson Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse und Dr. Brad Cookson für den Austausch von Laboreinrichtungen und Geräte.

Alle tierische Verfahren geprüft und bei der Universität von Washington institutionelle Animal Care und Use Committee Richtlinien durchgeführt.
(1) die Ernte des Knochenmarks
<ol><li>Aseptisch Femur und Tibia aus einer Maus herausnehmen und Reinigen der Knochen mit sterilen Instrumenten. Legen Sie die gereinigten Knochen in Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 50 mg/mL Gentamicin Sulfat + 10.000 U/mL Penicillin/Streptomyc...

<ol>
	<li>Jorgensen, I., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptotic+cell+death+defends+against+intracellular+pathogens.">Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens.</a> Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).</li><li>Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+action,+role+in+disease,+and+therapeutics.">Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics.</a> Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pore-Forming+Protein+Gasdermin+D+Regulates+Interleukin-1+Secretion+from+Living+Macrophages.">The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages.</a> Immunity. , (2017).</li></ol>

In dieser Handschrift haben wir zwei Techniken untersuchen Inflammasome Aktivierung und die Folge der Aktivierung der Caspase-1 nach NLRP3 Stimulation in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet vorgestellt. Die erste Technik ermöglicht den Forscher, die Aktivierung der Caspase-1 auf einer zellulären Basis mit fluoreszierenden Reporter FAM-YVAD-FMK bestimmen. Dieser Reporter ist hochspezifisch für die Bindung der Caspase-1-Familie von Enzymen, wie durch das Fehlen der Färbung in Caspase-1/11 mangelhaft Makrophagen ...

Inflammasome-vermittelte Entzündung zugrunde liegt auch die Ursache von vielen Krankheiten2ist ein wesentlicher Bestandteil der Abwehr pathogener Organismen1 Die entzündliche Reaktion auf eine Vielzahl von Infektionen ausgelöst durch cytosolische Nachweis des Erregers verbunden molekulare Muster (PAMPs) oder Schäden verbunden molekulare Muster (DAMPs). Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRR), einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder oligomerize auf den Nachweis dieser PAMPs und DAMPs. Dies löst die Bildung eines Multi-Protein-Komplex bezeichnet die Inflammasome, die die PRR, Adapter Protein Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein mit einer C-terminalen Caspase Recruitment Domain (Karte) (ASC) und pro-Form enthält Caspase-13,4. Diese Anlage ermöglicht Nähe-induzierte Auto-Aktivierung von Caspase-1. Aktive Caspase-1 führt dann zu einer Reihe von Ereignissen, die charakteristisch für die entzündliche Zelle Tod Weg Pyroptosis. Zu diesen Ereignissen gehören: die Spaltung und die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-18, Lysosomen Exozytose mit Freisetzung von lysosomalen Inhalts in den Extrazellulärraum, nukleare Kondensation und Gasdermin D Dekolleté. Die freigesetzte N-terminale Domäne des Gasdermin D fügt in der Plasmamembran, Bildung von Poren, die dazu führen, dass die Plasmamembran Bruch und Freisetzung von entzündlichen Inhalt, zusätzlich eine schützende Nische für Erreger Replikation5, wegnehmen 6 , 7.
Hier konzentrieren wir uns auf den gut untersuchten NLRP3-Inflammasome. Die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome erfolgt durch einen zweistufigen Prozess8. Der erste "Priming" Schritt erfolgt durch die Anerkennung von Toll-Like-Rezeptoren (TLR) eines mikrobiellen Produkts. Dies wird in der Laborumgebung repliziert, mithilfe von LPS, um TLR4 zu stimulieren. Diese Stimulation reguliert NLRP3 und Pro-IL-1β durch NF-κB-Signalisierung. Grundierung zusätzlich Lizenzen NLRP3 durch nicht-transcriptional Mechanismen durch Induktion der Deubiquitination9,10 und Phosphorylierung oder Dephosphorylation bestimmte Rückstände11,12.
Das zweite Signal für NLRP3 Aktivierung wird gedacht, um mitochondrialen Faktoren, reaktive Sauerstoffspezies, Kalium Ausfluss und Kalzium-Signalisierung, beinhalten ein einheitlicher Mechanismus für NLRP3 Aktivierung schwer fassbaren8bleibt. Aktivierte NLRP3 durch Interaktionen zwischen seinen NACHT-Domains oligomerizes und ASC über Bindung von Pyrin (PYD) Domänen13Rekruten. In jeder Zelle bilden diese makromolekulare Komplexe einen einzigen mikroskopisch sichtbaren Fokus. ASC wurde ursprünglich als ein 22 KDa-Protein, das einen "Fleck" während der Apoptose von menschlichen Leukämie-Zellen bildet und benannte Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein enthält eine Karte14identifiziert. Es wurde später festgestellt, dass ASC Pro-Caspase-1 durch das Zusammenspiel der Karte des ASC mit der Karte von Pro-Caspase-1, bilden die Inflammasome15Rekruten.
Nicht alle NLRs erfordern das Vorhandensein der ASC induzieren Caspase-1 Aktivierung. Im Gegensatz zu NLRP3 NLRC4 und NLRP1b Karte Domänen und Pro-Caspase-1 über Karte Interaktionen induzieren Caspase-1 Aktivierung direkt einstellen können. In Ermangelung von ASC aktive Caspase-1 bleibt diffus in die Zellflüssigkeit und bildet keinen einzigen Fokus. Diese diffuse aktive Caspase-1 ist ausreichend, um Pyroptotic Zelltod induzieren, aber ist nicht in der Lage, Pro-IL-1β13,16zu verarbeiten.
In diesem Manuskript besprechen wir zwei Möglichkeiten zur Aktivierung der Inflammasome zu beurteilen. Die erste verwendet die fluoreszierende Aktivität Sonde, FAM-YVAD-FMK, die die Caspase-1-Familie von Proteasen bindet. Diese Familie umfasst Caspase-1, aber auch Maus Caspase-11 und menschlichen Caspase-4 und Caspase-5. Makrophagen von Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse in allen Experimenten verwenden, wird die Spezifität dieser Sonde angesprochen werden. Diese Methode kann kombiniert werden mit Antikörper Kennzeichnung von Inflammasome Komponenten, die wir auch beschreiben. Mikroskopische Visualisierung ermöglicht die Identifizierung von einzelnen Zellen, die aktive Caspase-1 und oligomerized ASC. Forscher werden mit dieser Methode feststellen, wo in der Inflammasome-Bildung-Kaskade ihren Manipulationen der Wirtszelle oder pathogener Organismus unter Studie auswirken. Zum Beispiel kann man unterscheiden, ob eine bestimmte Intervention verhindert, die Rekrutierung von ASC, komplexe NLRP3 dass oder richtet sich an die nachfolgenden Rekrutierung und Aktivierung von Caspase-117. Ergebnisse der Caspase-1 Aktivierung wie IL-1β-Sekretion zu prüfen wäre nicht in der Lage sein, zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden. Auch, könnte die Sekretion von IL-1β geändert werden, ohne dass die Fähigkeit der Zellen zur Aktivierung der Caspase-1 und Pyroptotic Zelle Tod16zu unterziehen.
Die zweite Methode misst die Freisetzung von Laktat-Dehydrogenase (LDH) in die Zelle überstand, die auftritt, während Pyroptotic Makrophagen Lyse nach Aktivierung der Caspase-1, wie oben beschrieben. Diese zweite Methode ist eine bevölkerungsbezogene Ansatz wie die Freisetzung von LDH im gesamten gut gemessen wird. Dieser einfache Ansatz ermöglicht die schnelle Analyse von Proben (30 min Inkubation Zeit) um festzustellen, ob es Caspase-1-vermittelte Zelltod gibt und kann in einem 96-Well-Plattenformat durchgeführt werden.
Diese Methoden sind komplementär, jeweils mit verschiedenen Vorteilen, und beide sind Modifikationen leicht zugänglich. Beispielsweise kann Makrophagen Behandlung mit gezielten kleinen Molekulargewicht Verbindungen vor Inflammasome Stimulation verwendet werden, untersuchen die Rolle sicher, dass Proteine auf Entzündungsreaktionen Steuern haben können.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-MEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>For growing L929 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCRC clone 929 (L929)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer.&#160; Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR-G1780</td>
			<td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-YVAD-FMK</td>
			<td>Immunocytochemistry Technologies</td>
			<td>98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Heat inactivated at 55&#176;C for 50 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p36934</td>
			<td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse ALEXA555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21051024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>far-red fluorescent nucleic acid stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratoy</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-1/11-/- mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>016621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8X Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td>
			<td>List Biologicals</td>
			<td>434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ASC clone 2EI-7</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>04-417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercapto-ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax M3 plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>5000414</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes sind angeborene immun Signalisierung Plattformen, die für die erfolgreiche Bekämpfung vieler pathogenen Organismen sind erforderlich, sondern auch fördern entzündliche und Autoimmun-Krankheiten. Inflammasomes werden durch cytosolische Muster Anerkennung Rezeptoren, einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder aktiviert. Diese Rezeptoren oligomerize auf den Nachweis der mikrobiellen oder Schäden verbundenen Reize. Nachträgliche Einstellung des Adapter-Proteins ASC bildet eine mikroskopisch sichtbaren Inflammasome Komplex, die Caspase-1 durch Nähe-induzierte Auto-Aktivierung aktiviert. Nach der Aktivierung spaltet Caspase-1 Pro-IL-1β und Pro-IL-18, zur Aktivierung und Sekretion dieser Pro-inflammatorische Zytokine. Caspase-1 vermittelt auch entzündliche Form des Zelltods bezeichnet Pyroptosis, verfügt über den Verlust der Membran Integrität und Zell-Lyse. Caspase-1 spaltet Gasdermin D, die N-terminale Fragment, das Plasmamembran Poren bildet die Freigabe zu osmotische Lyse.
In Vitro, die Aktivierung von Caspase-1 kann durch Knochenmark stammenden Makrophagen mit der Caspase-1 Aktivität Sonde FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und Etikettierung der Zellen mit Antikörpern gegen das Adapter-Protein ASC ermittelt werden. Diese Technik ermöglicht die Identifikation von Inflammasome Bildung und Aktivierung der Caspase-1 in einzelnen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Pyroptotic Zelltod kann durch Messung der Veröffentlichung der cytosolischen Laktat-Dehydrogenase in das Medium erkannt werden. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und in einer 96-Well-Platte-Format, so dass die Anpassung für das Screening durchgeführt. In dieser Handschrift zeigen wir, dass die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome von Nigericin bis zur Co Lokalisierung der Adapter Protein ASC und aktive Caspase-1, führt zu Pyroptosis.

Um Caspase-1 Aktivierung nach der Exposition gegenüber Nigericin zu erkennen, wurden die Zellen verarbeitet, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Wir kombinierten FAM-YVAD-FMK und ASC Etikettieren Antikörper um zu zeigen, dass ASC und aktive Caspase-1 Co lokalisieren nach Aktivierung des NLRP3-vermittelten Inflammasome. Abbildung 1A zeigt, dass Wildtyp Makrophagen ausgesetzt 5 μM Nigericin Bildung von einer ASC-Fokus in der perinukleären Region. Diese ...

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Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

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Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

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The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

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