Name: detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

Microscopia de todos foi feito no W. M. Keck microscopia Center com suporte de Nathaniel Peters e com apoio do prêmio NIH S10OD016240. S.L.F. é suportado pelo NIH K08AI119142 e R21AI130281. Agradecemos o Dr. Richard Flavell e o Dr. Brad Cookson para camundongos deficientes de caspase-1/11 e o Dr. Brad Cookson para a partilha de equipamentos e instalações laboratoriais.

Todos os procedimentos de animais foram aprovados e conduzidos em Universidade das orientações do Comité de uso e cuidado Animal institucional do Washington.
1. colheita de medula óssea
<ol><li>Assepticamente, remover o fêmur e tíbia de um rato e limpar os ossos usando instrumentos esterilizados. Coloque os ossos limpos em meio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM) 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + sulfato de gentamicina 50 mg/mL + 10.000 U/mL penicilina/...

<ol>
	<li>Jorgensen, I., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptotic+cell+death+defends+against+intracellular+pathogens.">Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens.</a> Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).</li><li>Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+action,+role+in+disease,+and+therapeutics.">Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics.</a> Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+assembly,+regulation+and+signalling.">Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).</li><li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC,+a+novel+22-kDa+protein,+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells.">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC+is+essential+for+LPS-induced+activation+of+procaspase-1+independently+of+TLR-associated+signal+adaptor+molecules.">ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules.</a> Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).</li><li>Miao, E. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pore-Forming+Protein+Gasdermin+D+Regulates+Interleukin-1+Secretion+from+Living+Macrophages.">The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages.</a> Immunity. , (2017).</li></ol>

Neste manuscrito, apresentamos duas técnicas para examinar a ativação de inflammasome e a consequência da ativação de caspase-1 após estimulação NLRP3 em macrófagos murino derivadas da medula óssea. A primeira técnica permite que o pesquisador determinar o nível de ativação de caspase-1 em uma base celular usando o repórter fluorescente FAM-YVAD-FMK. Este repórter é altamente específico para a vinculação da caspase-1 família de enzimas, como visto pela ausência de coloração em macrófagos deficie...

Inflamação mediada por Inflammasome é um componente crítico da defesa contra organismos patogénicos1, mas também está subjacente a etiologia de muitas doenças2. A resposta inflamatória a uma ampla gama de infecções é acionada através da detecção citosólica do patógeno associado padrões moleculares (PAMPs) ou danos associados a padrões moleculares (represas). Receptores de reconhecimento padrão (PRR), incluindo membros da família de NOD-like receptor (NLR), oligomerize na detecção destes PAMPs e represas. Isto provoca a formação de um complexo de proteína multi denominado o inflammasome, que contém o PRR, a adaptador da proteína associada a apoptose grão-como contendo um domínio C-terminal de caspase-recrutamento (cartão) (ASC) e a pro-forma de caspase-13,4. Este complexo permite induzida por proximidade autoativação de caspase-1. Ativa a caspase-1, em seguida, leva a um conjunto de eventos que são característicos da pyroptosis de caminho de morte celular inflamatória. Estes eventos incluem: a clivagem e liberação das citocinas IL-1 β e IL-18, exocitose lisossomo com lançamento de conteúdo lisossomal no espaço extracelular, condensação nuclear e gasdermin D clivagem. O domínio N-terminal lançado de gasdermin D insere-se na membrana plasmática, formando poros que causam a ruptura da membrana plasmática e liberação do conteúdo inflamatório, além de tirar um nicho protetor para patógeno replicação5, 6 , 7.
Aqui, focalizamos o inflammasome NLRP3 bem estudado. A ativação do inflammasome NLRP3 ocorre através de um processo de duas etapas8. O primeiro passo "escorva" ocorre através do reconhecimento por receptores do tipo Toll (TLR) de um produto microbiano. Isto é replicado no cenário de laboratório usando LPS para estimular TLR4. Esta estimulação upregulates NLRP3 e pro-IL-1 β através de sinalização do NF-kB. Escorva adicionalmente licenças NLRP3 através de mecanismos não-transcriptional induzindo sua deubiquitination9,10 e fosforilação ou desfosforilação de resíduos específicos de11,12.
O segundo sinal para ativação NLRP3 é pensado para envolver fatores mitocondriais, espécies reativas de oxigênio, efluxo de potássio e cálcio, sinalização, apesar de um mecanismo unificador para ativação NLRP3 permanece elusiva8. NLRP3 ativado oligomerizes através de interações entre seus domínios NACHT e recrutas ASC através da ligação dos domínios pyrin (PYD)13. Em cada célula, estes complexos macromoleculares formam um único foco microscopicamente visível. ASC foi originalmente identificada como uma proteína KDa 22 que forma uma "mancha" durante a apoptose de células de leucemia humana e chamada apoptose-grão, como proteína associada contendo um cartão14. Mais tarde foi determinado que o ASC recrutas pro-caspase-1 através da interação do cartão da ASC com o cartão de pro-caspase-1, formando a inflammasome15.
Nem todos os NLRs exigem a presença de ASC para induzir a ativação de caspase-1. Ao contrário de NLRP3, NLRC4 e NLRP1b têm cartão domínios e diretamente podem recrutar pro-caspase-1 através de interações de cartão-cartão para induzir a ativação de caspase-1. Na ausência de ASC, ativa a caspase-1 permanece difusa por todo o citosol e não forma um único foco. Este ativo difusa caspase-1 é suficiente para induzir a morte celular de pyroptotic, mas é incapaz de processar a pro-IL-1 β13,16.
Neste manuscrito, discutiremos duas maneiras de avaliar a ativação de inflammasome. O primeiro usa a atividade fluorescente sonda, FAM-YVAD-FMK, que vincula a caspase-1 família de proteases. Esta família inclui caspase-1, mas também do mouse caspase-11 e caspase-4 humano e caspase-5. Usando os macrófagos de camundongos deficientes de caspase-1/11 em todos os experimentos, será abordada a especificidade da sonda. Esse método pode ser combinado com anticorpo rotulagem de inflammasome componentes, que também descreveremos. Visualização microscópica permite a identificação de células individuais contendo ativa a caspase-1 e oligomerized ASC. Usando esse método, os pesquisadores poderão determinar onde na cascata da formação inflammasome suas manipulações da célula hospedeira ou o organismo patogénico em estudo tem um efeito. Por exemplo, pode-se distinguir se uma determinada intervenção impede que o recrutamento de ASC para o NLRP3 complexo ou metas a subsequente recrutamento e ativação de caspase-117. Examinar os resultados da ativação de caspase-1 como a secreção de IL-1 β não seria capaz de distinguir entre estas duas possibilidades. Além disso, a secreção de IL-1 β poderia ser alterada sem alterar a capacidade de células para ativar caspase-1 e submeter-se pyroptotic célula morte16.
O segundo método mede a liberação de lactato desidrogenase (LDH) na célula de sobrenadante, que ocorre durante a lise de macrófagos pyroptotic seguindo a ativação de caspase-1, conforme descrito acima. Este segundo método é uma abordagem baseada na população, como a liberação de LDH em todo o bem é medida. Esta abordagem simples permite a análise rápida (30 minutos de tempo de incubação) das amostras para determinar se há morte celular mediada por caspase-1 e pode ser executada em um formato de placa de 96 poços.
Esses métodos são complementares, cada um com diferentes vantagens e ambos são facilmente passível de modificações. Por exemplo, tratamento de macrófagos com compostos alvo peso molecular pequeno antes da estimulação inflammasome pode ser usado para investigar o papel de certo proteínas podem ter sobre como controlar respostas inflamatórias.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-MEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>For growing L929 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCRC clone 929 (L929)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer.&#160; Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR-G1780</td>
			<td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-YVAD-FMK</td>
			<td>Immunocytochemistry Technologies</td>
			<td>98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Heat inactivated at 55&#176;C for 50 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p36934</td>
			<td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse ALEXA555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21051024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>far-red fluorescent nucleic acid stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratoy</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-1/11-/- mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>016621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8X Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td>
			<td>List Biologicals</td>
			<td>434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ASC clone 2EI-7</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>04-417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercapto-ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax M3 plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>5000414</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes são as plataformas sinalização imunes inatas que são necessários para o controle bem sucedido de muitos organismos patogénicos, mas também promovem inflamatória e doenças autoinflamatória. Inflammasomes são ativadas por receptores de reconhecimento padrão citosólica, incluindo membros da família do receptor (NLR) NOD-like. Estes receptores oligomerize na detecção de estímulos microbianas ou associada a danos. Recrutamento subsequente da proteína do adaptador ASC forma um complexo, de inflammasome microscopicamente visível que ativa a caspase-1 através da autoativação induzida por proximidade. Após a ativação, caspase-1 cliva pro-IL-1 β e pro-IL-18, levando à ativação e secreção dessas citocinas pró-inflamatórias. Caspase-1 também atua como mediador inflamatória forma de morte celular denominado pyroptosis, que apresenta a perda da lise de integridade e de célula de membrana. Caspase-1 fende gasdermin D, liberando o fragmento N-terminal que forma poros da membrana plasmática, levando a Lise osmótica.
In vitro, a ativação de caspase-1 pode ser determinado através da marcação de macrófagos derivados da medula óssea com a sonda de caspase-1 atividade FAM-YVAD-FMK e através da marcação das células com anticorpos contra a proteína do adaptador ASC. Esta técnica permite a identificação de inflammasome formação e ativação de caspase-1 em células individuais usando microscopia de fluorescência. Morte celular de Pyroptotic pode ser detectada medindo-se o lançamento do citosol lactato desidrogenase no meio de. Este procedimento é simples, custo-eficaz e realizado em um formato de placa de 96 poços, que permita a adaptação para a seleção. Neste manuscrito, mostramos que a ativação do inflammasome NLRP3 por nigericin leva à co localização da proteína do adaptador ASC e ativa a caspase-1, levando a pyroptosis.

Para detectar a ativação de caspase-1 após a exposição de nigericin, as células foram processadas conforme descrito na seção de protocolo. Nós combinamos ambos FAM-YVAD-FMK e ASC anticorpo rotulando a fim de mostrar que ASC e ativa a caspase-1 co localizar após ativação mediada por NLRP3 inflammasome. Figura 1A mostra que o tipo selvagem macrófagos expostos a 5 μM nigericin têm formação de um foco ASC na região perinuclear. Estes focos conte...

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Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

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Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...