Name: detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

Todos la microscopia se realizó en el centro W. M. Keck microscopia con el apoyo de Nathaniel Peters y con el apoyo del Premio NIH S10OD016240. Y es apoyada por los NIH K08AI119142 y R21AI130281. Agradecemos al Dr. Richard Flavell y Dr. Brad Cookson de ratones deficientes caspase-1/11 y el Dr. Brad Cookson para compartir equipos y laboratorios.

Todos los procedimientos animales eran aprobados y llevado a cabo en la Universidad de Washington institucional Animal Care y Comité de uso.
1. la cosecha de médula ósea
<ol><li>Asépticamente Remueva el fémur y la tibia de un ratón y limpiar los huesos usando instrumentos estériles. Coloque los huesos limpios en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 5 mM HEPES 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + 50 mg/mL gentamicina Sulfato + 10.000 U/mL de penicilina/estrep...

<ol>
	<li>Jorgensen, I., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptotic+cell+death+defends+against+intracellular+pathogens.">Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens.</a> Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).</li><li>Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+action,+role+in+disease,+and+therapeutics.">Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics.</a> Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pore-Forming+Protein+Gasdermin+D+Regulates+Interleukin-1+Secretion+from+Living+Macrophages.">The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages.</a> Immunity. , (2017).</li></ol>

En este manuscrito, hemos presentado dos técnicas para examinar la activación inflammasome y la consecuencia de la activación de la caspasa-1 después del estímulo NLRP3 en macrófagos derivados de médula ósea murinos. La primera técnica permite al investigador determinar el nivel de activación de la caspasa-1 basándose en los celulares usando el reportero fluorescente FAM-YVAD-FMK. Este reportero es altamente específico para atar la caspasa-1 familia de enzimas, como se ve por la ausencia de tinción en macró...

Inflamación mediada por Inflammasome es un componente crítico de la defensa contra organismos patógenos1, pero también es la base de la etiología de muchas enfermedades2. Citosólica detección de patrones moleculares asociado de patógeno (PMAP) activa la respuesta inflamatoria a una amplia gama de infecciones o daños asociados patrones moleculares (DAMPs). Receptores de reconocimiento de patrón (PRR), incluyendo a miembros de la familia NOD-like receptor (NLR), oligomerize a la detección de estos PAMPs y humedades. Esto provoca la formación de un complejo de varias proteína denominado inflammasome, que contiene el PRR, la proteína adaptadora asociada a Apoptosis Mota-como la proteína contiene un dominio c-terminal de reclutamiento de caspasas (CARD) (ASC) y la pro forma de caspasa-13,4. Este complejo permite proximidad inducida auto activación de caspasa-1. Caspasa-1 activo entonces conduce a un conjunto de eventos que caracterizan la muerte celular inflamatorio vía pyroptosis. Estos eventos incluyen: el escote y la liberación de las citoquinas inflamatorias IL-1β e IL-18, exocitosis de lisosomas con liberación de contenido lysosomal en el espacio extracelular, la condensación nuclear y gasdermin D escote. El dominio N-terminal liberado de gasdermin D inserta en la membrana plasmática, formando poros que provocan ruptura de la membrana plasmática y liberación del contenido inflamatorio, además de tomar a un nicho protector para patógeno replicación5, 6 , 7.
Aquí, nos enfocamos en el bien estudiado inflammasome NLRP3. La activación de la inflammasome NLRP3 se produce a través de un proceso de dos etapas8. El primer paso de "cebado" se produce a través del reconocimiento por los receptores Toll-like (TLR) de un producto microbiano. Esto se repite en el entorno de laboratorio mediante el uso de LPS para estimular el TLR4. Esta estimulación upregulates NLRP3 y pro-IL-1β mediante señalización NF-kB. Cebado además licencias NLRP3 a través de mecanismos no transcripcionales induciendo su deubiquitination9,10 y fosforilación o desfosforilación de residuos específicos11,12.
La segunda señal para la activación de NLRP3 se piensa para implicar factores mitocondriales, especies reactivas de oxígeno, eflujo de potasio y calcio de señalización, aunque un mecanismo unificador para la activación de NLRP3 sigue siendo difícil de alcanzar8. NLRP3 activado oligomerizes a través de interacciones entre sus dominios NACHT y recluta a ASC por atascamiento de los dominios de pirina (PYD)13. En cada célula, estos complejos macromoleculares forman un foco microscópico visible. ASC fue identificada originalmente como una proteína del KDa 22 que forma un "punto" durante la apoptosis de las células de leucemia humana y nombre asociada a apoptosis Mota-como la proteína que contiene una tarjeta14. Más tarde se determinó que la ASC reclutas pro-caspasa-1 a través de la interacción de la tarjeta de ASC con la tarjeta de pro-caspasa-1, formando el inflammasome15.
NLRs no todas requieren la presencia de ASC para inducir la activación de la caspasa-1. A diferencia de NLRP3, NLRC4 y NLRP1b tienen tarjeta dominios y pueden contratar directamente pro-caspasa-1 a través de las interacciones de la tarjeta-tarjeta para inducir la activación de la caspasa-1. En la ausencia de ASC, activa caspase-1 sigue siendo difuso en el citosol y no forma un solo foco. Este activo difuso caspasa-1 es suficiente para inducir la muerte celular de pyroptotic, pero es incapaz de procesar pro-IL-1β13,16.
En este manuscrito, discutiremos dos formas de evaluar inflammasome activación. La primera utiliza la actividad fluorescente sonda, FAM-YVAD-FMK, que se une a la familia de proteasas de caspasa-1. Esta familia incluye caspasa-1, pero también ratón caspasa-11 y humano caspasas-4 y caspasa-5. Mediante el uso de los macrófagos de ratones deficientes caspase-1/11 en todos los experimentos, se abordará la especificidad de este sondeo. Este método puede combinarse con anticuerpo etiquetado de componentes inflammasome, que también describiremos. Visualización microscópica permite la identificación de células individuales que contienen activos de caspasa-1 y oligomerized ASC. Usando este método, los investigadores podrán determinar que en la cascada de formación inflammasome sus manipulaciones de la célula huésped o el organismo patógeno en estudio tienen un efecto. Por ejemplo, uno puede distinguir si una intervención determinada impide la contratación de ASC para el complejo NLRP3 o apunta el posterior reclutamiento y activación de caspasa-117. Examinar los resultados de la activación de la caspasa-1 como la secreción de IL-1β no serían capaces de distinguir entre estas dos posibilidades. Además, la secreción de IL-1β podría modificarse sin alterar la capacidad de las células para activar la caspasa-1 y se someten a pyroptotic celular muerte16.
El segundo método mide la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante, la célula que ocurre durante la lisis del macrófago de pyroptotic tras la activación de caspasa-1 como se describe anteriormente. Este segundo método es un enfoque basado en la población como la liberación de LDH en todo el bien se mide. Este enfoque simple permite el análisis rápido (30 minutos de tiempo de incubación) de muestras para determinar si existe muerte celular mediada por caspasas-1 y se puede realizar en un formato de placa de 96 pocillos.
Estos métodos son complementarios, cada uno con diferentes ventajas y ambos son fácilmente susceptibles de modificaciones. Por ejemplo, tratamiento de macrófagos con objetivo pequeño peso molecular compuestos antes inflammasome estimulación puede utilizarse para investigar el papel de cierto proteínas pueden tener el control de las respuestas inflamatorias.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-MEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>For growing L929 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCRC clone 929 (L929)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer.&#160; Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR-G1780</td>
			<td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-YVAD-FMK</td>
			<td>Immunocytochemistry Technologies</td>
			<td>98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Heat inactivated at 55&#176;C for 50 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p36934</td>
			<td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse ALEXA555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21051024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>far-red fluorescent nucleic acid stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratoy</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-1/11-/- mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>016621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8X Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td>
			<td>List Biologicals</td>
			<td>434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ASC clone 2EI-7</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>04-417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercapto-ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax M3 plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>5000414</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes son plataformas señalización inmunes innatas que se requieren para el control exitoso de muchos organismos patógenos, sino que también promueven inflamatorias y enfermedades autoinflamatorias. Inflammasomes son activadas por receptores de reconocimiento de patrón citosólica, incluyendo a miembros de la familia de NOD-like receptor (NLR). Estos receptores oligomerize a la detección de estímulos microbianos o asociada a daño. Posterior reclutamiento de la proteína adaptador ASC forma un microscópico visible inflammasome complex, que activa la caspasa-1 a través de la auto activación inducida por proximidad. Después de la activación caspase-1 segmenta pro-IL-1β y pro-IL-18, conduciendo a la activación y secreción de estas citoquinas proinflamatorias. Caspasa-1 interviene también en la forma inflamatoria de muerte celular denominada pyroptosis, que cuenta con la pérdida de la lisis de integridad y de la célula de la membrana. Caspasa-1 golpea a gasdermin D, soltar el fragmento N-terminal que forma poros en membrana del plasma, llevando a la lisis osmótica.
In vitro, la activación de caspasa-1 se puede determinar por macrófagos derivados de médula ósea con la punta de prueba de actividad de caspasa-1 FAM-YVAD-FMK de etiquetado y etiquetado las células con anticuerpos contra la proteína adaptadora de ASC. Esta técnica permite la identificación de inflammasome formación y activación de la caspasa-1 en células individuales utilizando microscopía de fluorescencia. Pyroptotic la muerte celular puede detectarse midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa citosólica en el medio. Este procedimiento es simple, rentable y en un formato de placa de 96 pocillos, permitiendo la adaptación para la investigación. En este manuscrito, nos muestran que la activación de la inflammasome NLRP3 por nigericin conduce a la colocalización de la proteína adaptadora de ASC y activa caspasas-1, a pyroptosis.

Para detectar la activación de la caspasa-1 después de la exposición a nigericin, las células se procesaron como se describe en la sección de protocolo. Combinamos la FAM-YVAD-FMK y ASC anticuerpo etiquetado para demostrar que el ASC y activa caspase-1 co localización tras inflammasome NLRP3 mediada por activación. Figura 1A muestra que el tipo salvaje macrófagos expuestos a 5 μM nigericin tienen formación de un enfoque de la ASC en la región perin...

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Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

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Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...