Name: protein digestion, ultrafiltration, and size exclusion chromatography to optimize the isolation of exosomes from human blood plasma and serum
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum at JoVE.com

Cette recherche a été financée par des fonds internes de la CSU (à KMD), ATCC contrat #2016-0550-0002 (un contrat de sous-traitance de NIAID HHSN272201600013C) et la Fondation Bill et Melinda Gates (OPP1039688) (à KMD/NKG). Nous remercions l’expérience de recherche NSF pour les étudiants de premier cycle (REU) summer program à la Colorado State University pour un soutien supplémentaire.

Ce travail a été déterminé à ne pas être recherche sujet humain lors de l’examen initial de Colorado State University Institutional Review Board (IRB), comme tous les échantillons humains ont été obtenus sous forme d’échantillons anonymes de la Banque de tissus biologiques Bioreclamation IVT et ont été recueillis en vertu de protocoles approuvée de la CISR.
1. préparation de l’échantillon brut (Plasma ou sérum) par granulation plus grandes vésicules et débris cellulaires<...

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Une méthode optimisée pour augmenter la pureté et le rendement des exosomes de sang augmentera la capacité à la mienne avec précision les vésicules extracellulaires comme source de biomarqueurs pour plusieurs maladies. Les méthodes standard actuellement utilisés pour isoler les exosomes, plus précisément, ultracentrifugation et les méthodes de précipitation, ont plusieurs inconvénients dont exosome agrégation et enrobage de protéines solubles7,17<...

Exosomes sont nanovesicles (allant de 30 nm à 150 nm) publié par presque toutes les cellules dans le corps humain pour faciliter la communication de cellule-cellule traite1,2. Fait intéressant, la composition des exosomes change suivant les cellules d’origine ainsi que l’état de santé de l’individuel3,4,5. En outre, les exosomes peuvent être extraites de plusieurs fluides biologiques tels que : salive, l’urine et de sang2. Grâce à ces caractéristiques, exosomes sont considérés comme une bonne source de biomarqueurs de la maladie. Malheureusement, il n’y a aucune méthode standard pour l’isolement des exosomes. Certains laboratoires considèrent centrifugation plusieurs étapes, avec une dernière étape à grande vitesse à 100 000 x g utilisant des gradients de densité comme la méthode de l’étalon-or pour l’isolement de l’exosome. Toutefois, des études récentes ont montré qu’ultracentrifugation induit agrégation des exosomes avec protéines solubles et autres exosomes, en plus d’affecter l’intégrité de l’exosome, qui risquent d’entraver les applications en aval6,7 . Autres méthodes courantes d’isolement de l’exosome comprennent, mais ne se limitent pas à : précipitation par commercial polyéthylène glycol (PEG) base réactifs, ultrafiltration centrifuge et chromatographie d’exclusion stérique (SEC). Les réactifs commerciaux utilisant des polymères de polyéthylène glycol (PEG) enrichissent les exosomes en obligeant à précipiter et former une boulette. Limites à l’aide de ce polymère sont contamination résiduelle PEG polymère et une abondance de protéines solubles non-exosomal dans le produit final. Ultrafiltration utilise centrifugation pour purifier et concentrer les vésicules à l’aide d’une membrane de cellulose ; exosomes sont conservés au-dessus du filtre, tandis que les plus petites impuretés et autres protéines traversent la membrane7,8. Tout comme les autres méthodes, ultrafiltration centrifuge a une capacité limitée pour purifier les exosomes en raison du maintien de niveaux élevés de protéines non-exosomal, y compris les agrégats et les complexes protéiques. Enfin, purification SEC utilise une résine poreuse pour séparer les molécules selon la taille. SEC a montré des résultats prometteurs, surmontant la plupart des problèmes expérimentés avec d’autres méthodes en capturant la majorité des protéines contaminant et en préservant l’intégrité exosomal, étant donné que l’isolement est fondé sur la gravité ou de systèmes dépressionnaires7, 9. Toutefois, l’isolement Co de protéines plus gros agrégats et les lipoprotéines10 pendant SEC affecte la pureté de la préparation de l’exosome final. Alors que certaines méthodes ont été testées pour la purification de l’exosome de surnageants de culture de cellules et plasma7ou seulement plasma9,11, il n’y a aucune information sur la performance des méthodes comparant directement le sang plasma et sérum de la même personne.
Ici, nous nous concentrons sur la purification du sang exosomes en comparant une variété de flux de travail pour déterminer si les techniques d’enrichissement de vésicules sont traduisibles entre le sérum et le plasma. Nanoparticules, suivi, analyse et tache occidentale ont été utilisées pour quantifier les différences dans la composition de concentration, la pureté et protéine exosome dans les produits finaux. La dernière méthode, détaillée dans le présent protocole, augmente le nombre de vésicules et réduit les niveaux de protéines non-exosomal. Ce qui est important, une réduction drastique des protéines co précipitants communes dont l’albumine et apolipoprotéines est démontrée. La grande abondance de ces deux protéines dans le sang et la fréquence à laquelle ils purifient conjointement avec exosomes causes des incohérences entre les échantillons « purifiés », les analyses en aval de l’inclinaison. Ce protocole comprend l’utilisation d’une résine SEC disponible dans le commerce ; la résine est composée de perles poreux dans lequel protéines inférieures à 700 kDa peuvent entrer dans les perles. Une fois à l’intérieur, les protéines sont retenus par un ligand octylamine. L’éluat est composé de molécules supérieure à 700 kDa12et les exosomes. En outre, afin de réduire les agrégats de protéines et apolipoprotéines qui se soustraire de piégeage de la perle, nous incluons une étape de digestion de protéase dans le workflow. Actuellement, il n’y a aucune technique unique capable de maximiser l’exosome rendement tout en réduisant les co purification de protéines non-exosomal. Cette étude montre qu’un protocole de purification qui combine un prétraitement de digestion de protéase avec plusieurs méthodes de récupération et la purification peut être utilisé pour augmenter le rendement exosome et la pureté du sérum de sang et de plasma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Nanosight</td>
			<td style="width:149px;">Malvern</td>
			<td style="width:123px;">NS300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Benchtop microcentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Thermo</td>
			<td style="width:123px;">Legend Mico21</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">Allegra 6R</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Waterbath&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Benchmark</td>
			<td style="width:123px;">B2000-4</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:149px;">BIOTEK</td>
			<td style="width:123px;">Epoch</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">23227</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">23235</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">96 well plate</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">15705-066</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC510096</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC800324</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Capto Core 700</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">17548103</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Poly-Prep&#160;Chromatography Columns</td>
			<td style="width:149px;">BIORAD</td>
			<td style="width:123px;">7311550</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">NP0323BOX</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:149px;">BIORAD</td>
			<td style="width:123px;">1620112</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Proteinase K,&#160;Tritirachium album</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">539480</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">LC6065</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">SIGMAFAST&#160;BCIP/NBT</td>
			<td style="width:149px;">Millipore-SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">B5655</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">4-Chloro-1-naphthol</td>
			<td style="width:149px;">Millipore-SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">C6788</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:281px;">Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody</td>
			<td style="width:149px;">SYSTEM BIOSCIENCES</td>
			<td style="width:123px;">EXOAB-CD63A-1</td>
			<td style="width:124px;">Primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:281px;">ALB Antibody (F-10)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-271605</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:281px;">apoB Antibody (C1.4)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-13538</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:281px;">apoA-I Antibody (B-10)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-376818</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein digestion, ultrafiltration, and size exclusion chromatography to optimize the isolation of exosomes from human blood plasma and serum

Exosomes, un type de nanovesicle libéré de tous les types de cellules, peuvent être isolées de tout fluide corporel. Le contenu des exosomes, y compris les protéines et les ARN, est unique dans les cellules d'où ils proviennent et peuvent être utilisés comme indicateurs de maladie. Plusieurs protocoles communs de l’enrichissement, y compris ultracentrifugation, rendement exosomes chargés de contaminants de protéines solubles. Plus précisément, nous avons constaté que les protéines les plus abondantes dans le sang souvent co purifient avec exosomes et peuvent confondre des études protéomiques en aval, contrecarrer l’identification des candidats de biomarqueurs de faible abondance. Autre sujet de préoccupation est reproducibilité de dosage protéique exosome en raison de la représentation incompatible des concentrations de protéines non-exosomal. Le protocole détaillé ici a été développé pour éliminer les protéines non-exosomal qui purifient conjointement avec les exosomes, ajout de rigueur pour le processus de purification exosome. Cinq méthodes ont été comparées à l’aide de paires de plasma sanguin et le sérum de cinq donateurs. L’analyse en utilisant des nanoparticules, suivi, analyse et dosage de la protéine acide bicinchoninic micro a révélé qu’un protocole combiné utilisant la chromatographie d’exclusion de l’ultrafiltration et la taille ont donné l’enrichissement vésicule optimale et l’enlèvement de protéines solubles. Western Blot a été utilisée pour vérifier que les protéines de sang abondantes attendues, notamment l’albumine et apolipoprotéines, étaient épuisés.

Les données présentées ci-dessous ont été obtenues en utilisant des échantillons de sérum et le plasma de cinq donneurs de sang en bonne santé. Pour déterminer les effets de chaque étape du traitement, cinq variantes du protocole présenté ont été réalisés, et suppression de protéine récupération et non-exosome exosome ont été comparés. Les méthodes d’essai inclus : 1) SEC 700 kDa + Ultrafiltration 3 kDa ; 2) ultrafiltration 100 kDa ; 3) protéinase K + Ultrafil...

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Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Nous présentons ici un protocole visant à purifier les exosomes de plasma et de sérum réduit co purification de protéines sanguines non-exosomal. Le protocole optimisé inclut l’ultrafiltration, le traitement de la protéase et chromatographie d’exclusion. Améliorée de purification des exosomes des analyses en aval avantages, y compris la quantification plus précise des vésicules et la caractérisation de la protéomique.

Digestion des protéines, Ultrafiltration et chromatographie d’Exclusion afin d’optimiser l’isolement des Exosomes de sérum et de Plasma sanguin humain

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Research

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Évaluation rapide de la qualité des protéines membranaires par chromatographie d’exclusion de taille fluorescente

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...