Name: protein digestion, ultrafiltration, and size exclusion chromatography to optimize the isolation of exosomes from human blood plasma and serum
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי קרנות פנימי של CSU (כדי kmd ב), בקרת האוויר החוזה #2016-0550-0002 (קריעת של NIAID HHSN272201600013C), ו- ביל ומלינדה גייטס (OPP1039688) (כדי kmd ב/NKG). אנו מודים החוויה מחקר ה-NSF עבור תוכנית הקיץ סטודנטים (REU) באוניברסיטת קולורדו תמיכה נוספת.

עבודה זו הייתה נחושה לא להיות ניסויים בבני אדם מסקירה הראשונית של המוסדיים סקירת לוח (IRB של קולורדו סטייט), כמו כל דוגמאות האנושי התקבלו כפי שזוהו מבטל את דגימות biorepository Bioreclamation IVT והיו אסף תחת IRB אושרו פרוטוקולים.
1. הכנת המדגם גולמי (פלזמה או סרום) מאת Pelleting שלפוחית גדול ופסולת ?...

<ol>
	<li>Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+functions+of+exosomes.">The biogenesis and functions of exosomes.</a> Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Schorey, J. S., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+and+infectious+diseases:+new+complexity+to+an+old+story.">Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).</li><li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+platform+for+diagnosis+and+monitoring+of+traumatic+brain+injury.">Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).</li><li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer-derived+urine+exosomes:+a+novel+approach+to+biomarkers+for+prostate+cancer.">Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer.</a> Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research.">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).</li><li>Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-made+chromatography+columns+for+extracellular+vesicle+isolation+from+plasma.">Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).</li><li>S&#243;dar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Sci Rep. 6, 24316 (2016).</li><li>de Menezes-Neto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+as+a+stand-alone+methodology+identifies+novel+markers+in+mass+spectrometry+analyses+of+plasma-derived+vesicles+from+healthy+individuals.">Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).</li><li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+and+scalable+purification+of+extracellular+vesicles+using+combined+bind-elute+and+size+exclusion+chromatography.">Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).</li><li>Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+Membrane-Associated+Proteins+of+Exosomes+Released+from+Human+Macrophages+after+Mycobacterium+tuberculosis+Infection.">Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection.</a> Sci Rep. 6, 37975 (2016).</li><li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation.">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2006).</li><li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma.">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).</li><li>B&#246;ing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography.">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>Sweeney, P. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinase+K+(EC+3.4.21.14).">Proteinase K (EC 3.4.21.14).</a> Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).</li><li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma:+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods.">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).</li></ol>

שיטה ממוטבת כדי להגביר את הטוהר ואת התשואה של exosomes מדם תגדיל את היכולת שלי במדויק שלפוחית חוץ-תאית כמקור של סמנים ביולוגיים עבור מחלות מספר. בשיטות הרגילות, המשמשים כעת כדי לבודד exosomes, ליתר דיוק, ultracentrifugation ושיטות משקעים, יש מספר חסרונות כולל צבירת exosome, pelleting של חלבונים מסיסים7<...

Exosomes הם nanovesicles (החל בגודל של 30 ננומטר ל-150 ננומטר) שפורסמו על ידי כמעט כל התאים בגוף האדם כדי להקל על התקשורת לתא מעבד1,2. מעניין, ההרכב של exosomes משתנה בהתאם התאים של המקור, כמו גם מצב בריאותו של הפרט3,4,5. בנוסף, exosomes ניתן לאחזר מ נוזלים ביולוגיים כמה כגון: רוק, שתן, דם2. בשל תכונות אלה, exosomes נחשבים מקור טוב של סמנים למחלת. למרבה הצער, יש שיטה סטנדרטית עבור בידודו של exosomes. כמה מעבדות שקול צנטריפוגה רב-שלבי, בצעד מהיר הסופי ב g 100,000 x באמצעות מעברי צבע צפיפות כמו השיטה תקן הזהב exosome בידוד. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו ש-ultracentrifugation הזה גורם צבירה של exosomes עם חלבונים מסיסים ו exosomes אחרים, בנוסף כדי להשפיע את exosome שלמות, אשר שניהם עשויים ה"בלתי יישומי הזרם6,7 . שיטות נפוצות אחרות של בידוד exosome כוללים, אך אינם מוגבלים: משקעים על ידי מסחרי פוליאתילן גליקול (PEG) מבוסס ריאגנטים אולטראפילטרציה צנטריפוגלי, גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות). ריאגנטים מסחרי באמצעות פולימרים פוליאתילן גליקול (PEG) להעשיר exosomes על ידי גורם להם לזרז ויוצרים גלולה. מגבלות שימוש הפולימר הזה הם זיהום, עם פולימר פג שיורית, שפע של חלבונים מסיסים שאינם-exosomal במוצר הסופי. אולטראפילטרציה מנצל צנטריפוגה לטהר ולרכז שלפוחית באמצעות קרום תאית; exosomes נשמרים מעל המסנן, בזמן זיהומים קטנים וחלבונים אחרים עוברים הממברנה7,8. בדיוק כמו שיטות אחרות, אולטראפילטרציה צנטריפוגלי בעל קיבולת מוגבלת לטהר exosomes עקב השמירה של רמות גבוהות של חלבונים שאינם exosomal, כולל חלבון קומפלקסים אגרגטים. לבסוף, טיהור שניה משתמש שרף נקבובי כדי להפריד בין מולקולות לפי גודל. שניה הראתה תוצאות מבטיחות, להתגבר על רוב הבעיות מנוסה עם שיטות אחרות על-ידי לכידה הרוב המכריע של חלבונים מזהם של שמירה על שלמות exosomal, מאז בידוד מבוסס על כוח המשיכה או מערכות בלחץ נמוך7, 9. עם זאת, הבידוד שותף גדול יותר חלבון lipoproteins אגרגטים10 במהלך שניה משפיעה על הטוהר של הכנת exosome הסופי. בעוד כמה שיטות נבדקו לטיהור exosome supernatants התרבות תאים, פלזמה7, או רק פלזמה9,11, אין מידע על הביצועים של שיטות ישירות השוואת הדם פלזמה, סרום של אותו אדם.
כאן, אנו מתמקדים הטיהור של דם exosomes על-ידי השוואת מגוון של זרימות עבודה כדי לקבוע אם שלפוחית העשרה טכניקות לתרגום בין פלזמה לסרום. ננו-חלקיק מעקב אחר ניתוח תספיג שימשו כדי לכמת את ההבדלים בהרכב exosome, טוהר לריכוז החלבון במוצרי הקצה. שיטת הסופי, מפורט של פרוטוקול זה, מגביר את המספרים שלפוחית ומפחית רמות החלבון הלא-exosomal. חשוב, הפגינו ירידה דרסטית של חלבונים גורם משותף נפוץ כולל אלבומין, apolipoproteins. שפע גבוהה אלה שני חלבונים בדם ואת התדירות שבה הם שיתוף לטהר עם exosomes גורם חוסר עקביות בין דגימות "מזוכך", הטיית הניתוחים במורד הזרם. פרוטוקול זה כולל את השימוש שרף שניה זמינים מסחרית; השרף מורכב חרוזים נקבובי שבו חלבונים קטנים יותר 700 kDa באפשרותך להזין את החרוזים. פעם אחת בפנים, החלבונים נשמרות על-ידי ליגנד octylamine. Eluate מורכב exosomes של מולקולות גדולות יותר מ 700 kDa12. בנוסף, על מנת להפחית את אגרגטים חלבון ואת apolipoproteins אשר להתחמק חרוז השמנה, אנו כוללים צעד עיכול פרוטאז בזרימת העבודה. כיום, אין שום טכניקה יחיד מסוגל למקסם את התשואה exosome תוך צמצום שיתוף טיהור החלבונים הלא-exosomal. מחקר זה מראה כי פרוטוקול טיהור המשלב רעלני עיכול של פרוטאז עם שחזור מרובים ושיטות טיהור יכול לשמש כדי להגדיל את התשואה exosome וטוהר נסיוב הדם, פלזמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Nanosight</td>
			<td style="width:149px;">Malvern</td>
			<td style="width:123px;">NS300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Benchtop microcentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Thermo</td>
			<td style="width:123px;">Legend Mico21</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">Allegra 6R</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Waterbath&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Benchmark</td>
			<td style="width:123px;">B2000-4</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:149px;">BIOTEK</td>
			<td style="width:123px;">Epoch</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">23227</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">23235</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">96 well plate</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">15705-066</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC510096</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC800324</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Capto Core 700</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">17548103</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Poly-Prep&#160;Chromatography Columns</td>
			<td style="width:149px;">BIORAD</td>
			<td style="width:123px;">7311550</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">NP0323BOX</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:149px;">BIORAD</td>
			<td style="width:123px;">1620112</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Proteinase K,&#160;Tritirachium album</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">539480</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">LC6065</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">SIGMAFAST&#160;BCIP/NBT</td>
			<td style="width:149px;">Millipore-SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">B5655</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">4-Chloro-1-naphthol</td>
			<td style="width:149px;">Millipore-SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">C6788</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:281px;">Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody</td>
			<td style="width:149px;">SYSTEM BIOSCIENCES</td>
			<td style="width:123px;">EXOAB-CD63A-1</td>
			<td style="width:124px;">Primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:281px;">ALB Antibody (F-10)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-271605</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:281px;">apoB Antibody (C1.4)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-13538</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:281px;">apoA-I Antibody (B-10)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-376818</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein digestion, ultrafiltration, and size exclusion chromatography to optimize the isolation of exosomes from human blood plasma and serum

Exosomes, סוג של nanovesicle שוחררו כל סוגי תאים, יכול להיות מבודד בכל נוזלי. התכנים של exosomes, כולל חלבונים RNAs, הן ייחודיות על התאים שמהם הם נגזרים, יכול לשמש אינדיקטורים של המחלה. מספר פרוטוקולים העשרה נפוצות, כולל ultracentrifugation, תשואות exosomes עמוסות חלבון מסיס מזהמים. באופן ספציפי, מצאנו כי החלבונים הנפוץ ביותר בתוך דם לעיתים קרובות לטהר בשיתוף עם exosomes, יכולים לבלבל מחקרים פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם, שסיכל את הזיהוי של שפע נמוך סמן מועמדים. חשש נוסף הוא irreproducibility של exosome כמת חלבון עקב ייצוג לא עקבי של רמות החלבון הלא-exosomal. פרוטוקול מפורט כאן פותחה כדי להסיר חלבונים שאינם exosomal לטהר במשותף יחד עם exosomes, הוספת הקשיחות לתהליך טיהור exosome. חמש שיטות הושוו באמצעות לזווג פלזמה וסרום מתורמים חמש. ניתוח באמצעות ננו-חלקיק מעקב ניתוח ואת וזמינותו חלבון חומצה bicinchoninic מיקרו גילה כי פרוטוקול משולב ניצול כרומטוגרפיה הדרה אולטראפילטרציה וגודל הניב את שלפוחית אופטימלית העשרה והסרת חלבונים מסיסים. סופג המערבי שימש כדי לאמת החלבונים בדם שופע הצפוי, כולל אלבומין, apolipoproteins, היו דלה.

הנתונים המוצגים להלן התקבלו באמצעות דגימות פלסמה וסרום לזווג מתורמים בדם בריא חמש. כדי לקבוע את ההשפעות של כל שלב העיבוד, בוצעו 5 וריאציות של פרוטוקול שהוצגו ולאחר התאוששות exosome והסרת חלבונים שאינם exosome הושוו. השיטות trialed כללו: 1) kDa שניה 700 + kDa אולטראפילטרציה 3; 2) אולטראפילטר...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum at JoVE.com

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטהר exosomes פלזמה והן בסרום בטהרה שיתוף מופחתת של חלבוני דם בלתי-exosomal. פרוטוקול ממוטבת כולל אולטראפילטרציה פרוטאז לטיפול, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. טיהור משופרת של exosomes הטבות במורד הזרם ניתוחים, לרבות כימות מדויקת יותר של שלפוחית ואפיון פרוטיאומיה מבנית.

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

ריכוז מבוסס נייר ובידוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Analysis and Specification of Starch Granule Size Distributions

ניתוח ומפרט של הפצות גודל גרנול עמילן

Starch from all plant sources are made up of granules in a range of sizes and shapes having different occurrence frequencies, i.e., exhibiting a size and ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

בידוד וניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה על ידי Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

הערכה מהירה של איכות חלבון הממברנה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...