Name: protein digestion, ultrafiltration, and size exclusion chromatography to optimize the isolation of exosomes from human blood plasma and serum
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada por fundos internos da CSU (para KMD), ATCC contrato #2016-0550-0002 (um subcontrato de NIAID HHSN272201600013C) e a Fundação Bill e Melinda Gates (OPP1039688) (para KMD/NKG). Agradecemos a experiência de pesquisa do NSF para programa de Verão de alunos de graduação (REU) Universidade Estadual do Colorado para suporte adicional.

Este trabalho foi determinado a não ser sujeito humano pesquisa sobre revisão inicial da Colorado State University institucional Review Board (IRB), como todas as amostras humanas foram obtidas como amostras de identificados da biorepositórios Bioreclamation IVT e foram recolhidos no âmbito de protocolos IRB aprovado.
1. preparação da amostra bruta (Plasma ou soro) por vesículas maior granulação e restos celulares
Nota: Consideração de segu...

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	<li>Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+functions+of+exosomes.">The biogenesis and functions of exosomes.</a> Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Schorey, J. S., Harding, C. 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Um método otimizado para aumentar a pureza e o rendimento de exosomes de sangue irá aumentar a capacidade de precisão meu vesículas extracelulares como fonte de biomarcadores para várias doenças. O padrão métodos atualmente usados para isolar exosomes, especificamente, ultracentrifugação e métodos de precipitação, tem várias desvantagens incluindo exossomo agregação e granulação de proteínas solúveis7,17, 18...

Exosomes são nanovesicles (variando em tamanho de 30 nm a 150 nm) lançado por quase todas as células no corpo humano facilitar a comunicação célula a célula processa1,2. Curiosamente, a composição do exosomes muda dependendo das células de origem, bem como o estado de saúde do indivíduo3,4,5. Além disso, exosomes pode ser obtido em vários fluidos biológicos tais como: saliva, urina e de sangue2. Devido estas características, exosomes são considerados para ser uma boa fonte de biomarcadores da doença. Infelizmente, não há nenhum método padrão para a isolação de exosomes. Alguns laboratórios consideram centrifugação várias etapas, com uma etapa final de alta velocidade a 100.000 x g usando gradientes de densidade, como o método padrão-ouro para exossomo isolamento. No entanto, estudos recentes têm mostrado que ultracentrifugação induz agregação de exosomes com proteínas solúveis e outras exosomes, além de afetar a integridade do exossomo, ambos os quais podem dificultar a aplicações a jusante6,7 . Outros métodos comuns de isolamento do exossomo incluem, mas não estão limitados a: precipitação por comercial polietileno glicol (PEG) com base em reagentes, ultrafiltração centrífuga e cromatografia de exclusão-tamanho (SEC). Os reagentes comerciais usando polímeros de polietileno glicol (PEG) enriquecem exosomes, causando-lhes para precipitar e formar um pellet. Limitações de utilização deste polímero são contaminação residual polímero PEG e uma abundância de proteínas solúveis não-exosomal no produto final. Ultrafiltração utiliza centrifugação para purificar e concentrar-se vesículas usando uma membrana de celulose; exosomes são mantidos acima do filtro, enquanto as impurezas menores e outras proteínas atravessam a membrana7,8. Assim como outros métodos, ultrafiltração centrífuga tem uma capacidade limitada para purificar exosomes devido a manutenção de altos níveis de proteínas não-exosomal, incluindo agregados e complexos da proteína. Finalmente, purificação SEC usa resina porosa para separar moléculas por tamanho. SEC tem mostrado resultados promissores, superando a maioria dos problemas experientes com outros métodos, capturando a maioria das proteínas contaminantes e preservando a integridade exosomal, desde que o isolamento é baseado na gravidade ou sistemas de baixa pressão7, 9. No entanto, o isolamento co de proteínas maiores agregados e lipoproteínas10 durante o SEC afeta a pureza da preparação final exossomo. Enquanto alguns métodos foram testados para a purificação do exossomo de sobrenadantes de cultura de células e plasma7ou apenas plasma9,11, não há nenhuma informação sobre o desempenho dos métodos diretamente comparando o sangue plasma e soro do mesmo indivíduo.
Aqui, focalizamos a purificação do sangue exosomes, comparando uma variedade de fluxos de trabalho para determinar se as técnicas de enriquecimento de vesículas são traduzíveis entre plasma e soro. Nanopartículas, acompanhamento, análise e borrão ocidental foram usadas para quantificar as diferenças na composição de concentração, a pureza e a proteína exossomo em produtos finais. O método final, detalhado no presente protocolo, aumenta o número de vesículas e reduz os níveis de proteína não-exosomal. Importante, uma redução drástica das proteínas co precipitantes comuns, incluindo albumina e apolipoproteínas é demonstrada. A abundância destas duas proteínas no sangue e a frequência em que eles co purificam com exosomes causas inconsistências entre as amostras "purificadas", desviando as análises a jusante. Este protocolo inclui o uso de uma resina SEC comercialmente disponível; a resina é composta de grânulos porosos em que proteínas menores que 700 kDa podem inserir os grânulos. Uma vez dentro, as proteínas são retidas por um ligante de octylamine. O eluato é composto de exosomes e moléculas maiores que 700 kDa12. Além disso, a fim de reduzir a proteína agregados e apolipoproteínas que evade armadilhas do grânulo, incluímos um protease digestão passo do fluxo de trabalho. Atualmente, não existe única técnica capaz de maximizar o rendimento do exossomo reduzindo co purificação proteínas não-exosomal. Este estudo mostra que um protocolo de purificação que combina um pré-tratamento de digestão de protease com vários métodos de purificação e recuperação pode ser usado para aumentar o rendimento do exossomo e pureza de sangue soro e plasma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Nanosight</td>
			<td style="width:149px;">Malvern</td>
			<td style="width:123px;">NS300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Benchtop microcentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Thermo</td>
			<td style="width:123px;">Legend Mico21</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">Allegra 6R</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Waterbath&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Benchmark</td>
			<td style="width:123px;">B2000-4</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:149px;">BIOTEK</td>
			<td style="width:123px;">Epoch</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">23227</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">23235</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">96 well plate</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">15705-066</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC510096</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC800324</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Capto Core 700</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">17548103</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Poly-Prep&#160;Chromatography Columns</td>
			<td style="width:149px;">BIORAD</td>
			<td style="width:123px;">7311550</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">NP0323BOX</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:149px;">BIORAD</td>
			<td style="width:123px;">1620112</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Proteinase K,&#160;Tritirachium album</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">539480</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">LC6065</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">SIGMAFAST&#160;BCIP/NBT</td>
			<td style="width:149px;">Millipore-SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">B5655</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">4-Chloro-1-naphthol</td>
			<td style="width:149px;">Millipore-SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">C6788</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:281px;">Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody</td>
			<td style="width:149px;">SYSTEM BIOSCIENCES</td>
			<td style="width:123px;">EXOAB-CD63A-1</td>
			<td style="width:124px;">Primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:281px;">ALB Antibody (F-10)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-271605</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:281px;">apoB Antibody (C1.4)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-13538</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:281px;">apoA-I Antibody (B-10)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-376818</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein digestion, ultrafiltration, and size exclusion chromatography to optimize the isolation of exosomes from human blood plasma and serum

Exosomes, um tipo de nanovesicle liberado de todos os tipos de células, pode ser isolado de qualquer fluido corporal. O conteúdo de exosomes, incluindo proteínas e RNAs, é exclusivo para as células do qual eles são derivados e podem ser usados como indicadores de doença. Vários protocolos comuns de enriquecimento, incluindo ultracentrifugação, rendem exosomes carregado com contaminantes de proteína solúvel. Especificamente, nós encontramos que as proteínas mais abundantes no sangue muitas vezes co purificam com exosomes e podem confundir a jusante proteomic estudos, frustrar a identificação dos candidatos de biomarcador de baixa abundância. De preocupação adicional é a reprodutibilidade de quantificação de proteína exossomo devido inconsistente representação dos níveis de proteína não-exosomal. O protocolo detalhado aqui foi desenvolvido para remover as proteínas não-exosomal que purificam co juntamente com exosomes, adicionando o rigor do processo de purificação do exossomo. Cinco métodos foram comparados usando emparelhado plasma de sangue e soro de cinco doadores. Usando nanopartículas, acompanhamento, análise e ensaio de ácido da proteína de bicinchoninic micro a análise revelou que um protocolo combinado utilizando cromatografia de exclusão de ultrafiltração e tamanho rendeu o enriquecimento de vesículas ideal e remoção de proteína solúvel. Mancha ocidental foi utilizado para verificar que as proteínas do sangue abundante esperado, incluindo albumina e apolipoproteínas, foram esgotadas.

Os dados apresentados abaixo foram obtidos utilizando amostras de plasma e soro pareadas de cinco doadores de sangue saudáveis. Para determinar os efeitos de cada etapa de processamento, foram realizadas cinco variações do protocolo apresentado, e remoção de proteínas de recuperação e não-exossomo exossomo foram comparados. Os métodos julgados incluídos: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa; 2) ultrafiltração 100 kDa; 3) proteinase K + ultrafiltração 100 kDa; 4) SEC 700 ...

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Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Aqui, apresentamos um protocolo para purificar exosomes do plasma e soro com reduzida co purificação de proteínas do sangue não-exosomal. O protocolo otimizado inclui ultrafiltração, tratamento com proteases e cromatografia de exclusão. Reforçada purificação de exosomes análises benefícios a jusante, incluindo a quantificação mais precisa de vesículas e caracterização proteômica.

Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Bioquímica

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Cromatografia de troca iónica (IEX) acoplada ao multi-ângulo espalhamento de luz (MALS) para caracterização e separação de proteínas

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Analysis and Specification of Starch Granule Size Distributions

Análise e Especificação das Distribuições de Tamanho do Granulo de Amido

Starch from all plant sources are made up of granules in a range of sizes and shapes having different occurrence frequencies, i.e., exhibiting a size and ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Isolamento e Análise de Lipoproteínas plasmáticas por Ultracentrifugação

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Avaliação Rápida da Qualidade de Proteínas de Membrana por Cromatografia de Exclusão de Tamanho Fluorescente

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...