Name: protein digestion, ultrafiltration, and size exclusion chromatography to optimize the isolation of exosomes from human blood plasma and serum
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00
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Esta investigación fue apoyada por fondos internos del CSU (a KMD), ATCC contrato #2016-0550-0002 (un subcontrato de NIAID HHSN272201600013C) y la Fundación Bill y Melinda Gates (OPP1039688) (a KMD/recuperación). Agradecemos a la experiencia de investigación NSF para programa de verano de estudiantes universitarios (REU) en la Universidad Estatal de Colorado para soporte adicional.

Este trabajo se determinó no investigación de sujeto humano sobre la revisión inicial de Colorado State University institucional revisar Board (IRB), todas las muestras humanas fueron obtenidas como muestras anónima del biorepositorio de IVT Bioreclamation y recogido bajo protocolos IRB aprobado.
1. preparación de crudo muestra (Plasma o suero) por vesículas de mayor granulación y detritos celulares
Nota: Consideración de seguridad: plasma, su...

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	<li>Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+functions+of+exosomes.">The biogenesis and functions of exosomes.</a> Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Schorey, J. S., Harding, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research.">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).</li><li>Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. 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M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+Membrane-Associated+Proteins+of+Exosomes+Released+from+Human+Macrophages+after+Mycobacterium+tuberculosis+Infection.">Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection.</a> Sci Rep. 6, 37975 (2016).</li><li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation.">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2006).</li><li>Muller, L., Hong, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinase+K+(EC+3.4.21.14).">Proteinase K (EC 3.4.21.14).</a> Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).</li><li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma:+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods.">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).</li></ol>

Un método optimizado para aumentar la pureza y rendimiento de exosomas de sangre aumentará la capacidad de mina con precisión las vesículas extracelulares como fuente de biomarcadores para varias enfermedades. Los métodos estándar actualmente utilizados para aislar exosomas, específicamente, ultracentrifugación y métodos de precipitación, tienen varias desventajas incluyendo agregación de exosomas y granulación de proteínas solubles7,17, ...

Exosomas son Nanovesículas (que varían en tamaño desde 30 nm y 150 nm) facilitar la comunicación de célula a célula por casi todas las células en el cuerpo humano procesa1,2. Curiosamente, la composición de los exosomas cambia dependiendo de las células de origen, así como el estado de salud del individuo3,4,5. Además, exosomas pueden ser obtenido de varios fluidos biológicos tales como: saliva, orina y sangre2. Debido a estas características, exosomas se consideran una buena fuente de biomarcadores de la enfermedad. Desafortunadamente, no existe ningún método estándar para el aislamiento de exosomas. Algunos laboratorios consideran varios pasos centrifugación, con un paso de alta velocidad final a 100.000 x g utilizando gradientes de densidad como el método estándar de oro para el aislamiento de exosomas. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que ultracentrifugación induce la agregación de los exosomas con proteínas solubles y otras exosomas, además afectando la integridad de exosomas, que pueden obstaculizar las aplicaciones de bajada6,7 . Otros métodos de aislamiento de exosomas comunes incluyen, pero no se limitan a: precipitación por comercial polietilenglicol (PEG) basado en reactivos, centrífuga ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Los reactivos comerciales usando polímeros de polietilenglicol (PEG) enriquecen exosomas por haciéndolos precipitar y formar una pelotilla. Limitaciones de uso de este polímero son la contaminación con residuales polímeros de PEG y la abundancia de proteínas solubles no exosomal en el producto final. Ultrafiltración utiliza centrifugación para purificar y concentrar las vesículas con membrana de celulosa; exosomas se mantienen por encima del filtro, mientras que las impurezas más pequeñas y otras proteínas atraviesan la membrana7,8. Al igual que otros métodos de ultrafiltración centrífuga tiene una capacidad limitada para purificar exosomas debido a la retención de altos niveles de proteínas no exosomal, incluyendo agregados y complejos de la proteína. Por último, purificación seg utiliza resina porosa para separar moléculas por tamaño. SEC ha demostrado resultados prometedores, superar la mayoría de los problemas experimentados con otros métodos de captura de la mayoría de las proteínas contaminantes y preservar la integridad de la exosomal, puesto que el aislamiento se basa en la gravedad o sistemas de baja presión7, 9. Sin embargo, el aislamiento Co de mayor proteína agregados y lipoproteínas10 durante SEC afecta la pureza de la preparación final de exosomas. Mientras que algunos métodos han sido probados para la purificación de exosomas de sobrenadantes de cultivo de células y plasma7o9,de plasma solamente11, no hay información sobre el desempeño de métodos comparando directamente la sangre plasma y el suero del individuo mismo.
Aquí, nos centramos en la purificación de la sangre exosomas comparando una variedad de flujos de trabajo para determinar si las técnicas de enriquecimiento vesícula son traducibles entre plasma y suero. Nanopartículas de seguimiento análisis y western blot fueron utilizados para cuantificar las diferencias en la composición de proteína, concentración y pureza de exosomas en los productos finales. El método final, detallado en el presente Protocolo, aumenta el número de vesículas y reduce los niveles de proteína no-exosomal. Lo importante, se demostró una reducción drástica de común Co precipitando proteínas como albúmina y Apolipoproteínas. La gran abundancia de estas dos proteínas en sangre y la frecuencia en que co purifican con exosomas causas inconsistencias entre las muestras "purificadas", sesgando el análisis descendentes. Este protocolo incluye el uso de una resina de s disponible en el mercado; la resina se compone de granos porosos en que las proteínas menores de 700 kDa pueden introducir los granos. Una vez dentro, las proteínas son retenidas por un ligando Octilamina. El eluido se compone de exosomas y moléculas más grandes que 700 kDa12. Además, con el fin de reducir los agregados de proteínas y Apolipoproteínas que evaden captura de grano, se incluye un paso de digestión de proteasa en el flujo de trabajo. Actualmente, no es capaz de maximizar el rendimiento de exosomas reduciendo el co purificación proteínas no exosomal solo técnica. Este estudio muestra que un protocolo de purificación que combina un tratamiento previo de digestión de proteasa con varios métodos de recuperación y purificación puede usarse para aumentar el rendimiento de exosomas y pureza del suero sanguíneo y plasma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Nanosight</td>
			<td style="width:149px;">Malvern</td>
			<td style="width:123px;">NS300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Benchtop microcentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Thermo</td>
			<td style="width:123px;">Legend Mico21</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">Allegra 6R</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Waterbath&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Benchmark</td>
			<td style="width:123px;">B2000-4</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:149px;">BIOTEK</td>
			<td style="width:123px;">Epoch</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">23227</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">23235</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">96 well plate</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">15705-066</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC510096</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC800324</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Capto Core 700</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">17548103</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Poly-Prep&#160;Chromatography Columns</td>
			<td style="width:149px;">BIORAD</td>
			<td style="width:123px;">7311550</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">NP0323BOX</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:149px;">BIORAD</td>
			<td style="width:123px;">1620112</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Proteinase K,&#160;Tritirachium album</td>
			<td style="width:149px;">EMD-Millipore</td>
			<td style="width:123px;">539480</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td style="width:149px;">THERMO</td>
			<td style="width:123px;">LC6065</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">SIGMAFAST&#160;BCIP/NBT</td>
			<td style="width:149px;">Millipore-SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">B5655</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">4-Chloro-1-naphthol</td>
			<td style="width:149px;">Millipore-SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">C6788</td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:281px;">Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody</td>
			<td style="width:149px;">SYSTEM BIOSCIENCES</td>
			<td style="width:123px;">EXOAB-CD63A-1</td>
			<td style="width:124px;">Primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:281px;">ALB Antibody (F-10)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-271605</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:281px;">apoB Antibody (C1.4)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-13538</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:281px;">apoA-I Antibody (B-10)</td>
			<td style="width:149px;">SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td>
			<td style="width:123px;">sc-376818</td>
			<td style="width:124px;">Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein digestion, ultrafiltration, and size exclusion chromatography to optimize the isolation of exosomes from human blood plasma and serum

Exosomas, un tipo de nanovesicle liberado de todos los tipos de célula, pueden ser aislado de cualquier líquido corporal. El contenido de exosomas, incluyendo proteínas y ARN, es único a las células que se derivan y pueden ser utilizados como indicadores de enfermedad. Varios protocolos de enriquecimiento común, como la ultracentrifugación, producen exosomas cargado de contaminantes de la proteína soluble. Específicamente, hemos encontrado que las proteínas más abundantes en la sangre a menudo Co purifican con exosomas y pueden confundir los estudios proteómicos aguas abajo, frustrando la identificación de candidatos de biomarcadores de baja abundancia. De preocupación adicional es irreproducible de exosomas cuantificación de proteína debido a representación incompatible de niveles de proteína no-exosomal. El protocolo detallado aquí fue desarrollado para eliminar las proteínas no exosomal que co purifican junto con exosomas, adición de rigor en el proceso de purificación de exosomas. Cinco métodos se compararon mediante pares plasma de sangre y suero de cinco donantes. Análisis usando nanopartículas de seguimiento análisis y ensayo de proteína ácido bicinchoninic micro reveló que un protocolo combinado utilizando cromatografía por exclusión de tamaño y ultrafiltración dio como resultado el enriquecimiento óptima de la vesícula y la eliminación de la proteína soluble. Western Blot se utilizó para verificar que las proteínas de la sangre abundante esperados, incluyendo albúmina y Apolipoproteínas, estaban agotadas.

Los datos presentados a continuación fueron obtenidos usando las muestras pareadas de suero y plasma de donantes de sangre sanos de cinco. Para determinar los efectos de cada paso de proceso, se realizaron cinco variaciones del protocolo presentado, y se compararon los exosomas no exosomas y recuperación extracción de proteína. Los métodos probados incluyen: 1) seg 700 kDa + ultrafiltración 3 kDa; 2) ultrafiltración 100 kDa; 3) proteinasa K + ultrafiltración 100 kDa; 4) SEC 700 kD...

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Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Aquí, presentamos un protocolo para purificar exosomas de plasma y suero con menor Co purificación de proteínas de la sangre no exosomal. El protocolo optimizado incluye tratamiento con proteasas y ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño. Mayor purificación de exosomas beneficios aguas abajo los análisis, incluyendo la cuantificación más exacta de las vesículas y caracterización proteómica.

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Investigación

Bioquímica

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Cromatografía de intercambio iónico (IEX) acoplada a la dispersión de la luz de múltiples ángulo (MALS) para caracterización y separación de proteínas

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caracterización de proteínas por cromatografía de exclusión de tamaño acoplada a dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Preconcentración basada en papel y aislamiento de microvesículas y exosomas

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Analysis and Specification of Starch Granule Size Distributions

Análisis y especificación de distribuciones de tamaño de gránulo de almidón

Starch from all plant sources are made up of granules in a range of sizes and shapes having different occurrence frequencies, i.e., exhibiting a size and ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Aislamiento y análisis de lipoproteínas plasmáticas por ultracentrifugación

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Evaluación rápida de la calidad de la proteína de membrana mediante cromatografía de exclusión de tamaño fluorescente

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...