Name: the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00
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Questo lavoro è stato supportato in parte da Nihon farmaceutica University Research Grant da Nihon Pharmaceutical University (2016) e il JP17854179 di numero di MEXT KAKENHI Grant.

Protocolli sperimentali animali erano approvati dal comitato etico dell'Università Nihon Pharmaceutical ed eseguiti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Università Nihon Pharmaceutical. Il protocollo è stato regolato per estratti di tessuto derivati da topi ICR. Topi ICR sono stati acquistati da Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Giappone)
1. preparazione del substrato con etichetta Iminobiotin
Il substrato subisce sintesi in...

<ol>
	<li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+(a+review).">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li><li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein.">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li><li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases.">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li><li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin.">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li><li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li><li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer.">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li><li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo.">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li><li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics.">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li><li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates.">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li><li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin.">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+synthesis+of+a+tetrapeptide.">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li><li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2,4,6-trinitrobenzenesulphonic+acid.">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li><li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+NeutraLite+avidin:+A+non-glycosylated,+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties.">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li><li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography.">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li></ol>

Questo protocollo utilizza la spettrometria di massa MALDI-TOF per identificare specificità di proteasi in campioni grezzi derivati da estratti di tessuto e facilmente può essere scalato per elaborazione di campione più. In particolare, abbiamo maneggiato pH per causare un cambiamento nella specificità di substrato.
Il metodo (ABC) complesso avidina-biotina, che è stato ampiamente usato in biochimica a causa della sua specificità di legame, è stato utilizzato nel nostro protocollo. A ca...

Proteasi regolano processi fisiologici fendendo proteine, e l'avvio di attività di proteasi a orari specifici e posizioni è regolato1. Pertanto è importante per identificare l'espressione e l'attività dei tessuti che sono regolate localmente e per sviluppare un nuovo metodo per rilevare le proteasi. Il metodo proposto questo studio mira a identificare le specificità di proteasi in parallelo al rilevamento di proteasi.
Ci sono alcuni metodi per la rilevazione di specificità di proteasi. Il metodo azocaseina è ben noto per il suo utilizzo nella rilevazione di proteasi2 ma è limitato nella sua capacità di ottenere ulteriori informazioni. Zymography è un altro metodo di rilevamento di proteasi completa che può essere utilizzato per determinare il peso molecolare di proteasi3, ma non può essere utilizzato per esaminare la specificità di substrato. Specificità della proteasi può essere determinato dalle analisi spettrometriche, utilizzando substrati quali p-nitroanilide4e le analisi fluorometriche, utilizzando substrati di cumarina5 o fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) saggi6. Questi metodi consentono la rilevazione di singolo-specificità dei substrati contenute in un singolo pozzo. Nello studio presente, la specificità di proteasi di estratti di tessuto viene esaminata in varie condizioni, come questi estratti contengono proteasi multiple. L'attività della proteasi è regolata da diversi fattori, tra cui pH, coenzimi, gruppi prostetici e resistenza dello ione. Recentemente, metodi basati sulla proteomica sono state usate per identificare la specificità della proteasi; ad esempio, il metodo riportato da Biniossek et al. 7 utilizza il proteoma per determinare la specificità di substrato anche in estratti grezzi e consente la determinazione accurata dell'attività delle proteasi che riconoscono più dell'amminoacido sequenze8clivaggio. Tuttavia, questo metodo non è adatto per l'analisi di numerosi campioni. Al contrario, il nostro metodo consente l'elaborazione simultanea di più campioni e l'uso di Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) spettrometria di massa per l'analisi facilita la rilevazione rapida e facile della spaccati substrati.
Questa carta descrive un metodo per valutare la specificità della proteasi mediante spettrometria di massa MALDI-TOF per misurare il peso molecolare di substrati unici. Le forme molecolari di substrati spaccati, insieme al loro peso molecolare teorico, sono mostrate in Figura 1 e tabella 1. Gli studi precedenti hanno usato substrati contenenti polyglycine distanziali e biotina9; Tuttavia, questi substrati sono viziati perché la sequenza di polyglycine può essere clivata da enzimi che riconoscono la sequenza di glicina. Inoltre, l'alta affinità tra avidina e la biotina può portare a un tasso basso di recupero. Per migliorare questi inconvenienti, in questo studio che abbiamo sintetizzato un substrato unico, che era composta di polietilenglicole (PEG), iminobiotin e un aminoacido che potrebbe identificare il sito di clivaggio (Figura 1). Per discriminare tra amminoacidi di simili pesi molecolari, D-serina è stato aggiunto tra il distanziale di PEG e dell'aminoacido nel sito spaccati.
il N-terminale del substrato è stato etichettato con iminobiotin, che permette la purificazione di affinità da campioni di greggi. L'uso di iminobiotin invece di biotina è critico; la biotina ha una forte affinità con avidina, che si traduce in tassi di recupero basso di biotina substrati da resina avidina, mentre affinità di iminobiotin per avidina può essere alterato da pH. Iminobiotin-etichettati substrati legheranno per avidina in condizioni sopra pH 9, mentre avidina rilascia iminobiotin-etichettati substrati in condizioni sotto pH 4. Pertanto, iminobiotin è stato usato per la purificazione di affinità10. In breve, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione di specificità di proteasi utilizzando substrati unici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>209-1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triisopropylsilane (TIS)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanedithiol (EDT)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S6612278 403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Kokusan Chemical</td>
			<td>2153025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 cartridge column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT051910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(oxyethylene) octylphenyl ether</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>168-11805</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mixing homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>PT3100</td>
			<td>polytron homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>094-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>170-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin sepharose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-511-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTipC18</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry</td>
			<td>Bruker Daltonics, Germany</td>
			<td>autoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iminobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-amino acids</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes

Proteasi hanno diverse funzioni biologiche, tra cui la digestione della proteina di attivazione/inattivazione e cibo. Identificazione della proteasi specificità è importante per rivelare la funzione di proteasi. Il metodo proposto in questo studio determina la specificità della proteasi misurando il peso molecolare dell'unici substrati utilizzando Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization spettrometria di massa di tempo di volo (MALDI-TOF). I substrati contengono iminobiotin, mentre il sito fenduto è composto da aminoacidi, e il distanziatore è costituito da polietilene glicole. Il substrato fenduto genererà un unico peso molecolare usando un aminoacido spaccato. Uno dei meriti di questo metodo è che può essere effettuata in una pentola utilizzando campioni di greggi, ed è anche adatto per valutare campioni multipli. In questo articolo, descriviamo un metodo sperimentale semplice ottimizzato con campioni estratti dal tessuto polmonare di topo, compresa l'estrazione del tessuto, inserimento di substrati digestivi in campioni, purificazione dei substrati digestivi in condizioni di pH diversi e la misurazione del peso molecolare dei substrati utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF. In sintesi, questa tecnica consente l'identificazione della specificità di proteasi in campioni grezzi derivati da estratti di tessuto mediante spettrometria di massa MALDI-TOF, che facilmente può essere scalata per elaborazione di campione più.

Valutazione del metodo per l'identificazione della specificità di proteasi di proteasi di modello
L'efficienza di questo sistema è stata valutata usando TPCK-tripsina e V8 proteasi, cui specificità del substrato sono state ottenute. TPCK-tripsina e V8 proteasi sono stati stimati a fendere la sequenza dell'amminoacido al C-terminale dei residui di lisina e arginina e sul lato di carboxy del acido aspartico e acido glutammico resi...

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The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la specificità di proteasi in tessuto grezzo del mouse estratti usando spettrometria MALDI-TOF.

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Specie determinazione e la quantificazione in miscele Utilizzando MRM Spettrometria di massa dei peptidi applicata per l&#39;autenticazione a base di carne

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Ricerca

Biochimica

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