Name: the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00
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이 작품은 일본 제약 대학 (2016)과 문 부 과학성 KAKENHI 보조금 번호 JP17854179에서 일본 제약 대학 연구 보조금에 의해 부분에서 지원 되었다.

동물 실험 프로토콜 일본 제약 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 관심과 일본 제약 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 수행. 프로토콜 조직 추출 물의 ICR 생쥐에서 파생 된에 대 한 조정 되었습니다. ICR 생쥐 일본 SLC 회사 (일본 시즈오카)에서 구입 했다
1. Iminobiotin 표시 된 기판의 준비
기판 겪 습 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 그룹 (Fmoc)를 사용 하 여...

<ol>
	<li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+(a+review).">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li><li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein.">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li><li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases.">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li><li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin.">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li><li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li><li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer.">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li><li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo.">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li><li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics.">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li><li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates.">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li><li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin.">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+synthesis+of+a+tetrapeptide.">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li><li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2,4,6-trinitrobenzenesulphonic+acid.">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li><li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+NeutraLite+avidin:+A+non-glycosylated,+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties.">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li><li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography.">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li></ol>

이 프로토콜 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성을 식별 하 고 쉽게 여러 샘플 처리에 대 한 조정 될 수 있습니다. 특히, 우리는 기질 특이성에 변화를 일으킬 pH를 조작.
avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 (ABC) 메서드, 생화학의 바인딩 특이성 때문에 널리 이용 되는, 우리의 프로토콜에 이용 되었다. ABC의 강한 선호도, 인해 avidin 비?...

프로 테아 제, 단백질 절단형에 의해 생리 적 프로세스 조절 그리고 특정 시간과 장소에서 효소 활동의 개시는 규제1. 그러므로 식 및 로컬 규제, 조직의 활동을 식별 하 고 프로 테아 제를 감지 하는 새로운 방법을 개발 하는 것이 중요 하다. 에 제안 된 방법은이 연구 프로 테아 제를 감지 하는 동시에 효소 특이성을 식별 하는 것을 목표로.
효소 특이성을 탐지 하기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. Azocasein 메서드는 프로 테아 제2 의 검출에 사용을 위해 유명 하다 그러나 추가 정보를 얻을 하는 능력에 제한 된다. Zymography 프로 테아 제3의 분자량을 결정 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 종합 효소 검출 방식 이지만 기질 특이성을 검사 하는 데 사용할 수 없습니다. 효소 특이성 spectrometric 분석, 기판 p-nitroanilide4, 등을 사용 하 여 및 fluorometric 분석 실험, coumarin 기판5 또는 형광 공명 에너지 전송 (무서 워) 분석 실험6을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 이 메서드는 단일 잘에서 포함 하는 기판의 단일 특이성 탐지를 사용. 현재 연구에서 이러한 추출 물 포함 여러 프로 테아 제 효소 특이성 조직 추출의 다양 한 조건에서 검사 합니다. 효소 활동은 pH, 코엔자임, prosthetic 그룹, 이온 강도 등 여러 가지 요인에 의해 통제 된다. 최근, proteomics 기반 방법 효소 특이성;을 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 예를 들어, Biniossek 외에서 보고 하는 방법. 7 조 추출 물에도 기질 특이성을 결정 하는 프로테옴을 사용 하 고 여러 아미노산 시퀀스8을 인식 하는 프로 테아의 분열 활동의 정확한 결심을 허용 한다. 그러나,이 메서드는 수많은 샘플의 분석에 적합 하지. 우리의 메서드 여러 샘플의 동시 처리 및 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화의 사용을 사용 하는 반면, 시간의 비행 (TOF MALDI)는 쪼개진의 신속 하 고 쉽게 감지 샘플 분석을 위한 질량 분석에 용이 하 게 기판입니다.
이 종이 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 그들의 이론적 분자 무게, 함께 쪼개진된 기판의 분자 형태는 그림 1 과 표 1에 표시 됩니다. 이전 연구 polyglycine 스페이서 및 biotin9;를 포함 하는 기판 사용 그러나, 이러한 기판 polyglycine 시퀀스 글리신 시퀀스를 인식 하는 효소에 의해 죽 습 있을 수 있습니다 때문에 결함이 있습니다. 또한, avidin 비타민 b 복합체 사이 높은 선호도 낮은 회복 율을 이어질 수 있습니다. 하 우리는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG), iminobiotin, 및 분열 사이트 (그림 1)을 식별할 수 있는 아미노산의 구성 되었다 독특한 기질 합성이 연구에서는 이러한 단점에 향상. 유사한 분자 무게의 아미노산 사이 차별, D-떠들고 못 스페이서 사이 쪼개진된 사이트에서 아미노산 추가 되었습니다.
기판의 N 맨끝 원유 샘플에서 친 화력 정화를 가능 하 게 iminobiotin로 분류 됐다. Biotin 대신 iminobiotin의 사용은 매우 중요; biotin은 avidin, avidin에 대 한 iminobiotin의 선호도 pH에 의해 변경 될 수 있습니다 동안 avidin 수 지에서 biotin 표시 된 기판의 낮은 회수율 결과와 강한 선호도 하고있다. Iminobiotin 표시 된 기판 avidin pH 4 아래 조건에서 기판 iminobiotin 표시를 해제 하는 동안 pH 9, 위의 조건에서 avidin에 바인딩합니다. 따라서, iminobiotin는 친 화력 정화10사용 되었다. 요약, 우리는 독특한 기질을 사용 하 여 효소 특이성을 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>209-1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triisopropylsilane (TIS)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanedithiol (EDT)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S6612278 403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Kokusan Chemical</td>
			<td>2153025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 cartridge column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT051910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(oxyethylene) octylphenyl ether</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>168-11805</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mixing homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>PT3100</td>
			<td>polytron homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>094-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>170-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin sepharose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-511-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTipC18</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry</td>
			<td>Bruker Daltonics, Germany</td>
			<td>autoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iminobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-amino acids</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes

프로 테아 제 단백질 활성화/비활성화 및 음식 소화를 포함 하 여 여러 생물 학적 기능을가지고. 효소 특이성을 식별 하는 것이 효소 기능을 공개에 대 한 중요 합니다. 이 연구에서 제안 된 메서드는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 결정 합니다 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석. 기판 포함 iminobiotin, 쪼개진된 사이트 구성 아미노산, 그리고는 스페이서 이루어져 있다 폴 리 에틸렌 글리콜. 쪼개진된 기판 독특한 분자량 쪼개진된 아미노산을 사용 하 여 생성 됩니다. 이 방법의 장점 중 하나입니다 그것은 원유 샘플을 사용 하 여 한 냄비에 실행 될 수 있습니다 그리고 그것은 또한 여러 샘플을 평가 적합. 이 문서에서는, 우리는 마우스 폐 조직, 조직 추출, 소화 기판의에 배치 샘플, 다른 pH 조건 하에서 소화 기판의 정화 등에서 추출 하는 샘플으로 최적화 하는 간단한 실험 방법 설명 및 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 기판의 분자량의 측정. 요약 하자면,이 기술은 여러 샘플 처리에 대 한 쉽게 확장 될 수 있습니다 하는 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성의 식별에 대 한 수 있습니다.

모델 프로 테아 제에 의해 효소 특이성의 식별에 대 한 방법의 평가
이 시스템의 효율성은 TPCK-트립 신 및 V8 효소의 기질 특이성 가져온 사용 하 여 평가 되었습니다. TPCK-트립 신 및 V8 효소 아미노산 시퀀스 리 신과 아르기닌 잔류물의 C-터미널 및 aspartic 산 및 글루탐산 잔류물의 카 쪽에서 각각 쪼개 위하여 견적 되었다. 표...

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The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

고기 인증에 펩티드 응용의 MRM 질량 분석을 사용하여 혼합물에서 종 결정 및 정량

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...