Name: the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes at JoVE.com

Dette arbeidet var støttes delvis av den Nihon farmasøytiske University Research Grant fra Nihon farmasøytisk University (2016) og MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.

Dyr eksperimentelle protokollene ble godkjent av Nihon farmasøytisk universitetets etikk og utført i henhold til veiledning og bruk av forsøksdyr Nihon farmasøytisk University. Protokollen er justert for vev ekstrakter fra ICR mus. ICR mus ble kjøpt fra Nippon SLC Ltd (Shizuoka, Japan)
1. forberedelse av Iminobiotin-merket underlaget
Underlaget gjennomgår solid-fase syntese med 9-fluorenylmethyloxycarbonyl gruppe (Fmoc)-beskyttet aminosyrer som beskrevet under<s...

<ol>
	<li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+(a+review).">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li><li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein.">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li><li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases.">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li><li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin.">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li><li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li><li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer.">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li><li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo.">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li><li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics.">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li><li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates.">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li><li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin.">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+synthesis+of+a+tetrapeptide.">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li><li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2,4,6-trinitrobenzenesulphonic+acid.">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li><li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+NeutraLite+avidin:+A+non-glycosylated,+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties.">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li><li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography.">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li></ol>

Denne protokollen bruker MALDI-TOF massespektrometri for å identifisere protease spesifisitet i råolje prøver fra vev ekstrakter og kan enkelt skaleres for flere eksempel behandling. Spesielt manipulert vi pH å forårsake en endring i underlaget spesifisitet.
Avidin-biotin komplekse (ABC) metoden, som har vært mye brukt i biokjemi på grunn av sin bindende spesifisitet, ble benyttet i våre protokollen. På grunn av sterk affinitet av ABC er binding av avidin til biotin nesten uhelbredeli...

Proteaser regulere fysiologiske prosesser ved cleaving proteiner, og oppstart av protease aktivitet på bestemte tider og steder er regulert1. Det er derfor viktig å identifisere uttrykk og aktivitet av vev som er lokalt regulert, og å utvikle en ny metode for å oppdage proteaser. Metoden foreslått i denne studien har som mål å identifisere protease spesifisitet parallelt å oppdage proteaser.
Det er noen metoder for å oppdage protease spesifisitet. Metoden azocasein er kjent for sin bruk i deteksjon av proteaser2 , men er begrenset i sin evne til å skaffe ytterligere informasjon. Zymography er en omfattende protease oppdagelse metode som kan brukes til å bestemme molekylvekt proteaser3, men den kan ikke brukes til å undersøke substrat spesifisitet. Protease spesifisitet kan bestemmes av spectrometric analyser, bruker underlag som p-nitroanilide4, og fluorometric analyser, bruker kumarin underlag5 eller fluorescens resonans energi overføring (bånd) analyser6. Disse metodene kan enkelt-spesifisitet påvisning av underlag i en enkelt brønn. Studien undersøkes protease spesifisitet av vev ekstrakter under ulike forhold, som disse utdragene inneholder flere proteaser. Protease aktivitet er regulert av flere faktorer, inkludert pH, koenzymer, prosthetic grupper og ion styrke. Nylig brukes Proteomikk-baserte metoder til å identifisere protease spesifisitet; for eksempel metoden rapportert av Biniossek et al. 7 bruker proteom til å bestemme substrat spesifisitet selv i råolje ekstrakter og lar nøyaktig bestemmelse av cleavage aktiviteten til proteaser gjenkjenner flere amino acid sekvenser8. Men er denne metoden ikke egnet for analyse av mange eksempler. Derimot vår metode kan samtidig behandling av flere eksempler, og bruk av Matrix-Assisted Laser desorpsjon/ionisering tid-av-fly (MALDI-TOF) massespektrometri for eksempel analyse muliggjør rask og enkel oppdagelsen av den kløyvde underlag.
Denne artikkelen beskriver en metode for å vurdere protease spesifisitet ved hjelp av MALDI-TOF massespektrometri måle molekylvekt av unike underlag. De molekylære formene av kløyvde underlag, sammen med deres teoretiske molekylvekt, er vist i figur 1 og tabell 1. Tidligere studier har brukt underlag som inneholder polyglycine spacere og biotin9; men er disse underlag feil fordi polyglycine serien kan være kløyvde av enzymer som gjenkjenner glysin sekvensen. I tillegg kan til høy affinitet mellom avidin og biotin føre til en lav utvinningsgrad. Til å forbedre disse ulempene, i denne studien vi syntetisert en unik underlaget, som besto av polyetylenglykol (PEG), iminobiotin og en aminosyre som kan identifisere webområdet cleavage (figur 1). For å skille mellom aminosyrer av lignende molekylvekt, ble D-serine lagt mellom PEG avstandsstykket og aminosyren på cleaved stedet.
N-terminal av underlaget ble merket med iminobiotin, som gjør affinitet rensing fra råolje prøver. Bruk av iminobiotin i stedet for biotin er avgjørende; biotin har en kraftig affinitet med avidin, som resulterer i lav utvinningsgraden av biotin-merket underlag fra avidin harpiks, mens iminobiotin's affinitet for avidin kan endres ved pH. Iminobiotin-merket underlag vil binde til avidin forhold over pH 9, mens avidin utgivelser iminobiotin-merket underlag i forhold under pH 4. Iminobiotin ble derfor brukt affinitet rensing10. I sammendraget beskriver vi en detaljert protokoll for å oppdage protease spesifisitet bruker unike underlag.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>209-1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triisopropylsilane (TIS)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanedithiol (EDT)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S6612278 403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Kokusan Chemical</td>
			<td>2153025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 cartridge column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT051910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(oxyethylene) octylphenyl ether</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>168-11805</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mixing homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>PT3100</td>
			<td>polytron homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>094-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>170-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin sepharose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-511-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTipC18</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry</td>
			<td>Bruker Daltonics, Germany</td>
			<td>autoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iminobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-amino acids</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes

Proteaser har flere biologisk funksjoner, inkludert protein aktivering/deaktivering og mat fordøyelse. Identifisere protease spesifisitet er viktig for å avsløre protease-funksjonen. Metoden foreslått i denne studien bestemmer protease spesifisitet ved å måle molekylvekt av unike underlag bruker Matrix-assistert Laser desorpsjon/ionisering tid-av-fly (MALDI-TOF) massespektrometri. Substrater inneholder iminobiotin, mens cleaved området består av aminosyrer, og avstandsstykket består av polyetylenglykol. Cleaved substratet genererer en unik molekylvekt bruker en cleaved aminosyre. En av fordelene ved denne metoden er at den kan utføres i en pott med råolje prøver, og det er også egnet for å vurdere flere eksempler. I denne artikkelen beskriver vi en enkel eksperimentell metode optimalisert med eksempler Hentet fra musen lungevev, inkludert vev utvinning, plassering av fordøyelseskanal underlag i prøvene, rensing av fordøyelseskanal underlag under ulike pH-forhold , og måling av substrater molekylvekt bruker MALDI-TOF massespektrometri. I sammendraget gir denne teknikken identifikasjon av protease spesifisitet i råolje prøver fra vev ekstrakter bruker MALDI-TOF massespektrometri, som kan enkelt skaleres for flere eksempel behandling.

Evaluering av metoden for identifikasjon av protease spesifisitet av modellen protease
Effektiviteten av dette systemet ble evaluert med TPCK-trypsin og V8 protease, som substrat særegenheter ble innhentet. TPCK-trypsin og V8 protease ble beregnet deler aminosyresekvens ved C-terminalen av lysin og arginin rester og carboxy siden av aspartic syre og Glutaminsyre rester, henholdsvis. Tabell 1 viser den teoretiske M...

Watch this Scientific Journal Video about The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes at JoVE.com

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer

Her presenterer vi en protokoll for å bestemme protease spesifisitet i råolje musen vev ekstrakter bruker MALDI-TOF massespektrometri.

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Arter Bestemmelse og kvantifisering i blandinger Bruke MRM massespektrometri av Peptider Applied til Meat Authentication

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse av histonantistof spesifisitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definere Hsp33's Redox regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging Conformational endringer på Hsp33 med Hydrogen-deuterium Exchange massespektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...