Name: the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00
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Este trabalho foi financiado em parte pelo Nihon farmacêutica Universidade bolsa de pesquisa da Universidade de Nihon farmacêutico (2016) e o MEXT KAKENHI Grant número JP17854179.

Protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Nihon farmacêutico e realizados em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade Nihon farmacêutico. O protocolo foi ajustado para extratos de tecido derivados de camundongos ICR. Camundongos ICR foram comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japão)
1. preparação do substrato Iminobiotin-etiquetado
O substrato sofre a fase s...

<ol>
	<li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+(a+review).">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li><li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein.">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li><li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases.">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li><li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin.">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li><li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li><li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer.">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li><li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo.">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li><li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics.">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li><li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates.">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li><li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin.">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+synthesis+of+a+tetrapeptide.">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li><li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2,4,6-trinitrobenzenesulphonic+acid.">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li><li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+NeutraLite+avidin:+A+non-glycosylated,+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties.">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li><li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography.">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li></ol>

Este protocolo utiliza a espectrometria de massa MALDI-TOF para identificar a especificidade de protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido e facilmente pode ser ampliado para múltiplo processamento de amostra. Em particular, estamos manipulados pH para causar uma mudança na especificidade de substrato.
O método (ABC) complexo avidina-biotina, que tem sido amplamente utilizado em bioquímica devido à sua especificidade de ligação, foi utilizado em nosso protocolo. Devido a...

Proteases regulam processos fisiológicos por clivagem de proteínas, e o início da atividade de protease em horários específicos e locais é regulamentado1. Portanto, é importante identificar a expressão e a atividade dos tecidos que são regulamentados localmente e desenvolver um novo método para detectar proteases. O método proposto neste estudo visa identificar a especificidade da protease em paralelo para detecção de proteases.
Existem alguns métodos para a detecção de especificidade de protease. O método azocasein é conhecido por sua utilização na detecção de proteases2 mas é limitado em sua capacidade de obter mais informações. Zimografia é outro método de deteção de protease abrangente que pode ser usado para determinar o peso molecular de proteases3, mas não pode ser usado para examinar a especificidade de substrato. Especificidade de protease pode ser determinada por ensaios de espectrometria, usando substratos tais como p-nitroanilide4e ensaios fluorométrica, utilizando substratos de cumarina5 ou de ensaios de fluorescência ressonância energia transferência (FRET)6. Estes métodos permitem a detecção de single-especificidade de substratos contidos em um único poço. No presente estudo, a especificidade de protease de extratos de tecido é examinada sob várias condições, como estes extratos contêm várias proteases. Atividade de protease é regulada por vários fatores, incluindo pH, coenzimas, grupos prostético e força iônica. Recentemente, métodos baseados em proteômica têm sido usados para identificar a especificidade da protease; por exemplo, o método relatado por Biniossek et al. 7 usa a proteoma para determinar a especificidade de substrato mesmo em extratos brutos e permite a determinação exata da atividade de proteases que reconhecer várias sequências de aminoácidos8clivagem. No entanto, esse método não é adequado para a análise de várias amostras. Em contraste, o nosso método permite o processamento simultâneo de várias amostras e o uso de Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa para análise de amostra facilita a detecção rápida e fácil do clivada substratos.
Este artigo descreve um método para avaliar a especificidade do protease usando espectrometria de massa MALDI-TOF para medir o peso molecular de substratos exclusivos. As formas moleculares de substratos clivados, juntamente com seus pesos moleculares teóricos, são mostradas na Figura 1 e tabela 1. Estudos anteriores têm utilizados substratos contendo polyglycine espaçadores e biotina9; no entanto, estes substratos são falhos porque a sequência de polyglycine pode ser clivada por enzimas que reconhecem a sequência de glicina. Além disso, a alta afinidade entre avidina e biotina pode levar a uma taxa de recuperação de baixo. Para melhorar estes inconvenientes, neste estudo que nós sintetizado um substrato original, que era composto de polietileno glicol (PEG), iminobiotin e um aminoácido que pode identificar o local de clivagem (Figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso moleculares similares, D-serina foi adicionado entre o espaçador de PEG e o aminoácido no site entalhado.
O N-terminal do substrato foi rotulado com iminobiotin, que permite a purificação da afinidade de amostras brutas. O uso de iminobiotin em vez de biotina é crítico; Biotina tem uma forte afinidade com avidina, que resulta em taxas de baixa recuperação de substratos de biotina-rotulado de resina avidin, enquanto a afinidade do iminobiotin para avidin pode ser alterada por pH. Iminobiotin-rotulado substratos irão ligar para avidin nas condições acima pH 9, enquanto avidin libera substratos iminobiotin-etiquetadas em condições abaixo de pH 4. Portanto, iminobiotin foi usado para purificação de afinidade10. Em resumo, nós descrevemos um protocolo detalhado para a detecção de especificidade de protease usando substratos exclusivos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>209-1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triisopropylsilane (TIS)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanedithiol (EDT)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S6612278 403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Kokusan Chemical</td>
			<td>2153025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 cartridge column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT051910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(oxyethylene) octylphenyl ether</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>168-11805</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mixing homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>PT3100</td>
			<td>polytron homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>094-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>170-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin sepharose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-511-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTipC18</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry</td>
			<td>Bruker Daltonics, Germany</td>
			<td>autoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iminobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-amino acids</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes

Proteases têm várias funções biológicas, incluindo a digestão de alimentos e ativação/inativação de proteínas. Identificar a especificidade da protease é importante por revelar a função de protease. O método proposto neste estudo determina a especificidade de protease medindo-se o peso molecular de substratos exclusivos usando Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF). Os substratos contêm iminobiotin, enquanto o site clivado consiste de aminoácidos, e o espaçador é composto por polietileno glicol. O substrato clivado irá gerar um único peso molecular, usando um ácido aminado clivado. Um dos méritos desse método é que pode ser efectuada em uma panela, usando amostras brutas, e é também adequado para avaliar várias amostras. Neste artigo, descrevemos um método experimental simples otimizado com amostras extraídas do tecido do pulmão do rato, incluindo a extracção de tecido, colocação de substratos digestivos em amostras, purificação de substratos digestivos sob condições de pH diferente e medição de peso molecular dos substratos, utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. Em resumo, esta técnica permite a identificação da especificidade da protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido usando espectrometria de massa MALDI-TOF, que facilmente pode ser ampliada para múltiplo processamento de amostra.

Avaliação do método para a identificação da especificidade de protease por protease modelo
A eficiência deste sistema foi avaliada usando TPCK-tripsina e protease V8, cujas especificidades do substrato foram obtidas. TPCK-tripsina e protease V8 foram estimados para clivar a sequência de aminoácidos no C-terminal dos resíduos lisina e arginina e no lado de carboxila do ácido aspártico e ácido glutâmico resíduos, respec...

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The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

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Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

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Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

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Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Usando o pipeline de código aberto MALDI TOF-MS IDBac para análise de proteína microbiana e dados metabólito especializados

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