Name: the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av den Nihon farmaceutiska universitet forskningsanslag från Nihon läkemedels universitet (2016) och den MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.

Djura experimentella protokoll godkändes av Nihon läkemedels universitetets etiska kommitté och utförs i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur vid Nihon läkemedels universitetet. Protokollet har justerats för vävnad extrakt härrör från ICR möss. ICR möss köptes från Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japan)
1. beredning av substratet Iminobiotin-märkt
Substratet genomgår fasta fasen syntes använder 9-fluorenylmethyloxycarbonyl ...

<ol>
	<li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+(a+review).">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li><li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein.">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li><li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases.">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li><li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin.">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li><li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li><li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer.">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li><li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo.">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li><li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics.">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li><li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates.">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li><li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin.">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+synthesis+of+a+tetrapeptide.">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li><li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2,4,6-trinitrobenzenesulphonic+acid.">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li><li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+NeutraLite+avidin:+A+non-glycosylated,+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties.">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li><li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography.">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li></ol>

Detta protokoll används MALDI-TOF masspektrometri för att identifiera proteas specificitet i rå prover från vävnad extrakt och kan enkelt skalas för flera prov bearbetning. I synnerhet manipuleras vi pH för att orsaka en förändring i substrat specificitet.
Avidinen-biotin komplexa (ABC) metoden som har använts i biokemi på grund av dess bindande särart, utnyttjades i våra protokoll. På grund av den starka samhörighet av ABC är bindningen av metoden att biotin nästan oåterkall...

Proteaser reglera fysiologiska processer genom att klyva proteiner och inledandet av proteas aktivitet på bestämda tider och platser är reglerade1. Det är därför viktigt att identifiera uttryck och aktivitet av vävnader som regleras lokalt, och att utveckla en ny metod för att upptäcka proteaser. Metoden som föreslås i denna studie syftar till att identifiera proteas specificitet parallellt till att upptäcka proteaser.
Det finns några metoder för att upptäcka proteas specificitet. Azocasein metoden är välkänt för dess användning för detektion av proteaser2 men är begränsad i sin förmåga att få ytterligare information. Zymography är en annan omfattande proteas detektionsmetod som kan användas för att bestämma molekylvikten för proteaser3, men det kan inte användas för att undersöka substrat specificitet. Proteas specificitet kan bestämmas av spektrometriska analyser, använder substrat såsom p-nitroanilide4, och fluorometric analyser, använder kumarin substrat5 eller fluorescens resonans energi överföring (bandet) analyser6. Dessa metoder aktivera single-specificitet detektering av substrat som ingår i en enda brunn. I den aktuella studien undersöks proteas specificitet vävnad extrakt under olika villkor, eftersom dessa utdrag innehåller flera proteaser. Proteas aktivitet styrs av flera faktorer, inklusive pH, coenzymer, prosthetic grupper och ion styrka. Nyligen, proteomik-baserade metoder har använts för att identifiera proteas specificitet; till exempel, den metod som rapporterats av Biniossek et al. 7 använder proteomet för att avgöra substrat specificitet även i rå extrakt och tillåter noggrann bestämning av aktiviteten klyvning av proteaser som känner igen flera amino syra ordnar8. Men är denna metod inte lämplig för analys av många prover. Däremot vår metod möjliggör samtidig bearbetning av flera prover, och användningen av laser Laser Desorption/jonisering Time-of-Flight (MALDI-TOF) masspektrometri för provanalys underlättar snabb och enkel detektion av den klyvs substrat.
Detta dokument beskriver en metod för att utvärdera proteas specificitet med hjälp av MALDI-TOF masspektrometri för att mäta molekylvikten för unika substrat. De molekylära formerna av klyvs substrat, tillsammans med deras teoretiska molekylvikt, visas i figur 1 och tabell 1. Tidigare studier har använt substrat som innehåller polyglycine distanser och biotin9. dessa substrat är dock bristfällig eftersom den polyglycine sekvensen kan vara klyvs av enzymer som känner igen sekvensen glycin. Dessutom kan hög affinitet mellan avidinen och biotin leda till en låg återvinningsgrad. Att förbättra dessa nackdelar, i denna studie vi syntetiseras en unik substrat, som bestod av polyetylenglykol (PEG), iminobiotin och en aminosyra som kunde identifiera webbplatsen klyvning (figur 1). För att diskriminera mellan aminosyror av liknande molekylvikter, lades D-serine mellan PEG mellanlägget och den amino syran på webbplatsen klyvs.
N-terminalen av substratet var märkt med iminobiotin, som möjliggör affinitet rening från rå prover. Användning av iminobiotin i stället för biotin är kritisk; Biotin har en stark samhörighet med avidinen, vilket resulterar i låg återvinningsgrad av biotin-märkt substrat från avidinen harts, medan iminobiotin's affinitet för avidinen kan ändras av pH. Iminobiotin-märkt substrat binder till avidinen i villkoren ovan pH 9, medan metoden släpper iminobiotin-märkt substrat i villkoren nedan pH 4. Därför användes iminobiotin för affinitet rening10. Sammanfattningsvis beskriver vi ett detaljerat protokoll för att upptäcka proteas specificitet med hjälp av unika substrat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>209-1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triisopropylsilane (TIS)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanedithiol (EDT)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S6612278 403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Kokusan Chemical</td>
			<td>2153025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 cartridge column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT051910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(oxyethylene) octylphenyl ether</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>168-11805</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mixing homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>PT3100</td>
			<td>polytron homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>094-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>170-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin sepharose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-511-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTipC18</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry</td>
			<td>Bruker Daltonics, Germany</td>
			<td>autoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iminobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-amino acids</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes

Proteaser har flera biologiska funktioner, inklusive protein aktivering och inaktivering och mat matsmältning. Identifiera proteas specificitet är viktigt för att avslöja proteas funktion. Den metod som föreslås i denna studie bestämmer proteas specificitet genom att mäta molekylvikten för unika substrat med Matrix-assisted Laser Desorption/jonisering Time-of-Flight (MALDI-TOF) masspektrometri. Substratesna innehåller iminobiotin, medan klyvs webbplatsen består av aminosyror och distansringen består av polyetylenglykol. Klyvs underlaget kommer att generera en unik molekylvikt med hjälp av en aminosyra som klyvs. En av fördelarna med denna metod är att det kan utföras i en kruka med rå prover, och den är också lämplig för att bedöma flera prover. I den här artikeln beskriver vi en enkel experimentell metod optimerad med prover ur musen lungvävnad, inklusive vävnad utvinning, placering av mag substrat i prover, rening av mag substrat under olika pH förhållanden , och mätning av de substrat molekylvikt med hjälp av MALDI-TOF-masspektrometri. Sammanfattningsvis kan denna teknik för identifiering av proteashämmare specificitet i rå prover från vävnad extrakt med MALDI-TOF masspektrometri, som enkelt kan skalas för flera prov bearbetning.

Utvärdering av metoden för identifiering av proteashämmare specificitet av modell proteas
Effektiviteten av detta system utvärderades med hjälp av TPCK-trypsin och V8-proteas, vars substrat särdrag erhölls. TPCK-trypsin och V8 proteashämmare uppskattades för att klyva den amino syra ordningen på C-terminalen av lysin och arginin rester, och vid karboxi sidan av asparaginsyra och glutaminsyra rester, respektive. Ta...

Watch this Scientific Journal Video about The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes at JoVE.com

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestämning av proteashämmare specificitet i mus vävnad extrakt av MALDI-TOF-masspektrometri: manipulera PH för att orsaka specificitet förändringar

Här presenterar vi ett protokoll att bestämma proteas specificitet i rå mus vävnad extrakt med MALDI-TOF-spektrometri.

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Artbestämning och kvantifiering i blandningar Använda MRM masspektrometri av peptider som kött autentisering

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analys av histonantikroppspecificitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturläsning och DNA reparation Assay använder Single Nucleotide förlängning och MALDI-TOF-masspektrometri.

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Med öppen källkod MALDI TOF-MS IDBac pipeline för analys av mikrobiellt protein och specialiserade Metabolitdata

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...