Name: the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes at JoVE.com

Bu eser kısmen Nihon ilaç Üniversitesi Araştırma Bursu Nihon ilaç Üniversitesi (2016) ve MEXT KAKENHI Grant numarası JP17854179 tarafından desteklenmiştir.

Hayvan deneysel protokoller Nihon ilaç Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Nihon ilaç Üniversitesi kılavuzlarınıza uygun olarak yürüttü. Protokol doku özleri ICR fareler türetilmiş için ayarlandı. ICR fareler Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japonya) satın alınan
1. Iminobiotin etiketli substrat hazırlanması
9-fluorenylmethyloxycarbonyl grubu (Fmoc) kullanarak katı fazlı sentez substrat uğr...

<ol>
	<li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+(a+review).">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li><li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein.">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li><li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases.">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li><li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin.">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li><li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li><li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer.">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li><li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo.">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li><li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics.">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li><li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates.">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li><li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin.">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+synthesis+of+a+tetrapeptide.">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li><li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2,4,6-trinitrobenzenesulphonic+acid.">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li><li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+NeutraLite+avidin:+A+non-glycosylated,+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties.">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li><li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography.">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li></ol>

Bu iletişim kuralı MALDI-TOF Kütle spektrometresi proteaz özgüllük doku özler elde edilen ham örneklerinde tanımlamak için kullanır ve kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli. Özellikle, pH substrat özgüllüğü bir değişiklik neden manipüle.
Yaygın Biyokimya onun bağlama özgüllüğü nedeniyle kullanılmıştır, avidin-biotin karmaşık (ABC) yöntemi, bizim iletişim kuralında kullanılmıştır. ABC güçlü yakınlığı nedeniyle, avidin biotin için bağ...

Proteaz proteinler fizyon tarafından fizyolojik süreçleri düzenleyen ve belirli zamanlarda ve yerlerde proteaz aktivitesinin başlangıcında düzenlenmiş1. Bu nedenle ifade ve yerel olarak düzenlenmiştir dokuların aktivite tanımlama ve proteaz algılamak için yeni bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Önerilen yöntem bu çalışma proteaz özgüllük proteaz tespit için paralel olarak tanımlamak amaçlamaktadır.
Proteaz özgüllük algılamak için bazı yöntemler vardır. Azocasein yönteminin kullanımı ile proteaz2 algılanması için iyi bilinen ama onun yetenek daha fazla bilgi almak için sınırlıdır. Zymography, proteaz3molekül ağırlığı belirlemek için kullanılan başka bir kapsamlı proteaz algılama yöntemi olmakla birlikte, substrat özgüllüğü incelemek için kullanılamaz. Proteaz özgüllük spektrometrik deneyleri, p-nitroanilide4gibi yüzeylerde kullanarak ve Fluorometrik deneyleri, coumarin yüzeylerde5 veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) deneyleri6kullanarak tarafından belirlenebilir. Bu yöntemler tek bir kuyuda bulunan yüzeylerde tek-özgüllük algılanmasını etkinleştirin. Bu özler birden çok proteaz içeren çalışmanın, doku özleri proteaz özgüllük çeşitli koşullar altında incelenir. Proteaz aktivitesi pH, koenzimler, prostetik gruplar ve iyon gücü de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından düzenlenmiştir. Son zamanlarda, proteomik tabanlı yöntemleri proteaz özgüllük tanımlamak için kullanılmıştır; Örneğin, Biniossek ve arktarafından bildirilen yöntemi. 7 Proteom substrat özgüllüğü bile içinde ham özleri belirlemek için kullanır ve birden çok amino asit dizileri8tanımak proteaz bölünme etkinliğinin doğru belirlenmesi sağlar. Ancak, bu yöntem çok sayıda örnekleri analiz için uygun değildir. Buna ek olarak, bizim Yöntem birden çok örneği aynı anda işleme ve kullanım Matrix-Assisted Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma sağlar saat uçuş (MALDI-TOF) örnek analiz için kütle spektrometresi i ciddi, hızlı ve kolay algılama kolaylaştırır yüzeylerde.
Bu kağıt proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçmek için MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak değerlendirmek için bir yöntem özetliyor. Onların kuramsal moleküler ağırlıkları birlikte i ciddi yüzeylerde moleküler formları Şekil 1 ve Tablo 1' de gösterilmiştir. Önceki çalışmalarda polyglycine çubukları ve biotin9içeren yüzeylerde kullanılan; Ancak, polyglycine sıra glisin sıra tanımak enzimler tarafından i ciddi çünkü bu yüzeylerde hatalı. Ayrıca, yüksek afinite avidin ve biotin arasında düşük kurtarma oranı için neden olabilir. Polietilen glikol (PEG), iminobiotin ve bölünme sitesi (Şekil 1) teşhis edebilecek bir amino asit oluşan benzersiz bir substrat sentezlenmiş Bu çalışmada bu sakıncaları üzerine geliştirmek için. Benzer moleküler ağırlık amino asitler arasında ayırımcılık için D-serin PEG spacer ve amino asit cleaved sitesinde arasında eklendi.
N-terminal substrat, benzeşim arıtma ham örneklerinden sağlayan iminobiotin ile etiketli oldu. İminobiotin yerine biotin kullanımı önemlidir; biotin avidin avidin için iminobiotin'ın ilgi pH tarafından değiştirilebilir iken hangi biotin etiketli yüzeylerde avidin reçine, düşük oranda düşük kurtarma sonuçlar ile güçlü bir ilgi vardır. İminobiotin etiketli yüzeylerde pH 4 aşağıdaki koşullarda avidin bültenleri iken Iminobiotin etiketli yüzeylerde avidin pH 9, yukarıdaki koşullarda bağlayacaksınız. Bu nedenle, iminobiotin benzeşme arıtma10için kullanıldı. Özetle, biz proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde kullanarak tespit için detaylı bir protokol tanımlamak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperidine</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>209-1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triisopropylsilane (TIS)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanedithiol (EDT)</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>A00057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S6612278 403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Kokusan Chemical</td>
			<td>2153025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 cartridge column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT051910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(oxyethylene) octylphenyl ether</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>168-11805</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mixing homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>PT3100</td>
			<td>polytron homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>094-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Nakarai Chemical</td>
			<td>170-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>WAKO Chemical</td>
			<td>043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin sepharose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-511-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTipC18</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry</td>
			<td>Bruker Daltonics, Germany</td>
			<td>autoflex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iminobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-amino acids</td>
			<td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes

Proteaz protein harekete geçirmek/inactivation ve gıda sindirimi de dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyonları var. Proteaz özgüllük tanımlayan proteaz işlevi ifşa için önemlidir. Bu çalışmada önerilen yöntem matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kullanarak benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçerek proteaz özgüllüğü belirler saat uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi. Cleaved site amino asitleri oluşur ve boşluk Ekleyici Polietilen glikol oluşur yüzeylerde iminobiotin, içerir. Cleaved substrat cleaved bir amino asit kullanarak benzersiz bir moleküler ağırlığı oluşturur. Bu yöntem yararları bu ham numuneleri kullanılarak bir tencereye yürütülen ve aynı zamanda birden fazla örnekleri değerlendirmek için uygundur biridir. Bu makalede, biz basit bir deneysel Yöntem doku çıkarma, sindirim yüzeylerde yerleşimini farklı pH koşullarında sindirim yüzeylerde arıtma örnekleri, içine dahil olmak üzere fare akciğer dokusundan elde örnekleri ile optimize tarif ve yüzeylerde moleküler ağırlık MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak ölçümü. Özet olarak, bu teknik proteaz özgüllük ham örneklerinde kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak doku özleri elde tanımlanması için izin verir.

Proteaz özgüllük modeli proteaz tarafından tanımlanması için yöntem değerlendirilmesi
Bu sistemin verimliliği TPCK-tripsin ve V8 proteaz olan substrat özelliklerine elde edilmiştir, kullanılarak değerlendirilmiştir. TPCK-tripsin ve V8 proteaz amino asit dizisi lizin ve arginin kalıntılarının C terminalinde ve carboxy yanında aspartik asit ve glutamik asit kalıntıları eklenmesi, sırasıyla ayırmak için tahm...

Watch this Scientific Journal Video about The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes at JoVE.com

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Et kimlik doğrulaması için peptidler Uygulanan MRM Kütle Spektrometresi kullanarak karışımlar türlerin belirlenmesi ve miktar tayini

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...