Name: retrospective microrna sequencing: complementary dna library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded rna specimens
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens at JoVE.com

אנו מודים ד ר תומאס Tuschl, ראש המעבדה לביולוגיה מולקולרית RNA, כמו גם חברי המעבדה שלו על תמיכתם ועל שיתוף הטכנולוגיה שפותחה מעבדה ועל מתן גישה הצינור RNAworld. אנו מודים גם ד ר מרקוס Hafner שיתוף הפרוטוקול, לספק תיאורים מפורטים על כל השלבים הביוכימי, אנזימטי היה בהליך הראשוני שלו.

1. הכנת כל ריאגנטים, תחל
<ol><li>להזמין כל תחל ומתאמי כמתואר באיור1.</li>
	<li>
הכינו כיל המקנה קוקטייל, אשר עלה בכל מצדו בודדים.
	<ol>
<li>Resuspend oligonucleotide המוביל (איור 1) 0.5 מיקרומטר עם RNase ללא מים. Resuspend את oligonucleotides כיל 10 (איור 1) 100 מיקרומטר באמצעות ה?...

<ol>
	<li>Peir&#243;-Chova, L., Pe&#241;a-Chilet, M., L&#243;pez-, J. A., Garc&#237;a-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality.">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li><li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excavation+of+a+buried+treasure--DNA,+mRNA,+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed,+paraffin+embedded+tissues.">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li><li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues:+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients.">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).</li><li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity.">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li><li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues.">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li><li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples.">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li><li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues.">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517 (2013).</li><li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues.">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).</li><li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li><li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR:+the+strengths+and+pitfalls.">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li><li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR.">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li><li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays.">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144 (2011).</li><li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples.">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li><li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue:+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance.">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li><li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+and+cancer.">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li><li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis,+prognosis+and+targets+for+therapy.">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li><li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies.">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500 (2011).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li><li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens.">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).</li><li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+DNA/RNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs,+mRNAs,+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens.">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).</li><li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailovi&#263;, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing.">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li><li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing,+selection,+extension+and+ligation+platform:+assessing+its+performance+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma.">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li></ol>

פרוטוקול הכנה ספריית cDNA חזקים הדירים מאוד עבור הגדרות של RNAs קטן בארכיון ב- FFPE RNA דגימות מוצג פרוטוקול זה, אשר היא גרסה שהשתנתה וממוטב של ההליך המתואר על ידי Hafner. et al. 22
כל השלבים של פרוטוקול זה מוטבו לשימוש עם בוגרים RNA הכולל, בארכיון, פרוץ התאוששה FFPE דגימות. הש...

miRNAs ההכפלה שמורים להפליא היטב פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) דגימות1,2,3. העבודות הקודמות הוכיחה כי הביטוי של אלה קצרה תקינה ללא קידוד יחיד נטושים מולקולות RNA יכול בהצלחה להעריך באמצעות RNA הכולל מדגימות FFPE, לספק נתונים ביטוי גנים הרלוונטיים בהשוואה הטרייה המקורי רקמות4,5,6,7,8. בהשוואה RNAs שליח גדול, אשר הוכחו להיות מושפעת באופן ביקורתי עיבוד רקמות (פורמלדהיד, חום, לייבוש, וכו ') FFPE, RNases אנדוגני, הגיל של דגימות, גודל קטן של miRNAs (~ 18 – 24 נוקלאוטידים) מופיעה כדי שיהיו עמידים בפני השפלה וגמיש לאחסון לטווח ארוך, גם הדגימו באמצעות מחקרים ביטוי miRNA לפעול טוב יותר תפוקה גבוהה לימודי ה-mRNA דגימות בארכיון9. miRNA ביטוי מחקרים באמצעות דגימות קליניות בארכיון, אשר רובם בוצעו בניתוח בקנה מידה קטן, הפגינו הסינגל או מרובב מבחני ה-PCR כמותי, סוגים שונים של טכנולוגיות microarray, ולאחרונה המיתרים יכול ניתן להשתמש כדי להעריך את הביטוי של miRNAs נשמר לאחר אופטימיזציה של אלה מבחני10,11,12,13,14.
בהתחשב בכך dysregulation של הביטוי miRNA היה קשור עם פיתוח מגוון רחב של גידולים ממאירים האנושית, שיש כאן פוטנציאל אטומטי העצום של קלינית מבואר דגימות בארכיון, זה הפך להיות לכאורה כי אלה RNA קטנים מולקולות מייצגים מבטיח מקור פוטנציאלי סרטן סמנים ביולוגיים15,16,17,18. השימוש בטכנולוגיה ביטוי גנים תפוקה גבוהה כגון הגדרות יש את היתרון של מתן הערכה גלובלית של כל הפרוטוקולים miRNA בהשוואה לטכנולוגיות יישוב כגון PCR ו/או מיקרו-מערכים19. מסיבה זו, פרוטוקול ממוטבת, ובמחיר בקלות החלים על הכנה ספריית cDNA של RNAs קטנים של מבוגר דגימות בארכיון עבור הגדרות אופטימלי כדי לאפשר מחקרים רטרוספקטיבית רחבת היקף20.
הקמנו בעבר פרוטוקול מיצוי RNA/DNA סימולטני להתאוששות נפרדים של RNA ו- DNA דגימות בארכיון בוגרים, אשר מצאנו כדי לפעול טוב יותר עכשווי קיטים מסחריים21. באמצעות פרוטוקול זה החילוץ, כדי להשיג RNA הכולל רקמות FFPE בארכיון לתקופה ממושכת של פעמים, אנו אופטימיזציה ההכנה של ספריות cDNA המיתרים של miRNAs המשומרים דגימות קליניות עד 35 שנים. יתרה מכך, במחקר שפורסם לאחרונה שבו הכנו cDNA ספריות קרצינומה ductal קלינית מסווג , באתרו (DCIS) דגימות, זיהינו באופן שונה ביטוי miRNAs היו לאימות על ידי PCR כמותי, אשר הצביע כי שינויים בביטוי miRNA מסוימים עשויים להיות לזיהוי בנגעים DCIS מחולים מי לפתח סרטן השד בהשוואה ל- DCIS נגעים של חולים אשר אינם מפתחים סרטן השד.
בהתחשב העלות של ערכות מסחריות להכנה של ספריות cDNA RNA קטנים, את הפוטנציאל שלהם הפסקה, כמו גם את השימוש ריאגנטים המוגנים בזכויות יוצרים/פטנט שלא יכול להיות מוטב, החלטנו להתאים שפורסמו בעבר מבוסס המעבדה ונטולת ערכת 3' לבר-קוד cDNA ספריית הכנת פרוטוקול עבור הגדרות של RNAs קטן בארכיון ב FFPE דגימות, המאפשר ניתוח בו זמנית של 18 דוגם22. פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב אידיאלי וחזק עם הערכה הטכניים מחסומים, שהיו קריטי עבור ההסתגלות דגימות FFPE RNA, ויש לו פוטנציאל חזק עבור יישום למקורות אחרים של פרוץ או קשה כדי להשתמש בחומר RNA. הישימות של הפרוטוקול המקורי היה משופר על ידי החלפת סמני גודל radioactively שכותרתו עם פלורסנט (למשל, זהב SYBR) לזיהוי סמני גודל של RNA, בשימוש במהלך הבחירה של ספריות מחוברים על גדול לזיהוי ג'לים. פרוטוקול ממוטבת זה מסתמך על מצדו של 3' מתאמי לבר-קוד כדי 18 דגימות FFPE RNA בודדים, אשר ואז איחדו יחד לעבור 5' מתאם מצדו, הפוכה-תמלול ולאחר ניתוח PCR פיילוט עבור המותאמים הגברה של cDNA סופית ספריית לפני בקנה מידה גדול PCR הגברה טיהור, המיתרים על ברצף תפוקה גבוהה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Triton x-100</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM ATP</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8110G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X dNTPs</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8110G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14M Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O3445I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 nt ladder</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>M-232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mg/ml Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8894-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X Titanium Taq</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>639208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9170-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5424R</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>4054-4537Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppndorf Thermomixer</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>4053-8223Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Breaker Tube 0.5 ml</td>
			<td>IST Engineering Inc,</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jersey-Cote</td>
			<td>LabScientific, Inc</td>
			<td>1188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KcL 2M</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 1M</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge dual rotor personal centrifuge</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers</td>
			<td>Ciore Life Science</td>
			<td>21070010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Defined during order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme PmeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Imager 2.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Imager 2.0 blue light transilluminator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III reverse transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrGold</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0351L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Themocycler with heated lid</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4359659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 1M pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 1M pH8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-833</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrospective microrna sequencing: complementary dna library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded rna specimens

– בארכיון, קלינית מסווגים פורמלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות (FFPE) יכול לספק חומצות גרעין ללימודי מולקולרית רטרוספקטיבה של התפתחות סרטן. באמצעות נגעים לא פולשנית או טרום ממאיר של חולים אשר מאוחר יותר לפתח מחלה פולשנית, ניתוחים ביטוי גנטי עשוי לעזור לזהות שינויים מולקולריים מוקדם שגורמים את הסיכון לסרטן. זה טוב תואר חומצות גרעין התאוששה FFPE רקמות עברו נזק פיזי חמור, שינויים כימיים, אשר תעשה שלהם ניתוח קשה ודורש בדרך כלל מבחני מותאם. מיקרו Rna (miRNAs), עם זאת, אשר מייצגים את שיעור קטן של מולקולות RNA פורש רק עד ~ 18 – 24 נוקלאוטידים, הוכחו לעמוד לאחסון לטווח ארוך, יש נותחו בהצלחה בדגימות FFPE. כאן אנו מציגים 3' לבר-קוד משלים דנ א (cDNA) ספריית הכנה פרוטוקול במיוחד ממוטבים לניתוח של RNAs קטן שחולצו מן הרקמות שאוחסנו בארכיון, אשר הודגם לאחרונה להיות חזקים מאוד לשחזור בעת שימוש בארכיון דגימות קליניות מאוחסן עד 35 שנים. הכנת ספריה הוא מותאם לניתוח מולטיפלקס של החומר נחשף/השפיל בהם דוגמאות RNA (עד 18) מאתרים עם מתאמי לבר-קוד בודדות 3', ואז איחדו יחד על ההכנות אנזימטי וביוכימי עוקבות לפני ניתוח. כל purifications מתבצעים על ידי לזיהוי בג'ל (עמוד), אשר מאפשר הבחירות הספציפיות גודל ו enrichments מינים RNA קטנים לבר-קוד. הכנת ספריית cDNA הוא מותאם תשומות RNA דקה, כמו טייס תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) מאפשרת קביעה של מעגל הגברה מסוימת לייצר סכומי מיטביים של חומר עבור הדור הבא רצפי (הגדרות). גישה זו היה מותאם לשימוש של RNA מפורק FFPE של דגימות בארכיון עד 35 שנים ומספק ביותר לשחזור נתונים המיתרים.

כפי שמתואר כאן, השיטה סך של 18 דגימות FFPE RNA בודדים (100 ng בכל) מוגדרים צינורות נפרדת לעבור 3' adenylated לבר-קוד oligonucleotide T4 מצדו בן לילה. למחרת, תגובות אנזימטיות בוטלה-חום, בשילוב, זירז צינור יחיד. בגדר RNA הוא resuspended ומופרדים מולקולות RNA מחוברים ב- 15% denaturing לזיהוי ג'ל (עמוד), שבו סמני גודל ...

Watch this Scientific Journal Video about Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens at JoVE.com

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

פורמלין-קבוע דגימות פרפין-מוטבע מהווים מקור חשוב של סמנים מולקולריים של מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכנה ספריית cDNA מבוסס המעבדה, בתחילה עוצב עם RNA טריים קפואים, באופן מיטבי עבור הניתוח של מיקרו Rna בארכיון של רקמות מאוחסן עד 35 שנים.

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...