Name: retrospective microrna sequencing: complementary dna library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded rna specimens
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens at JoVE.com

우리는 박사 토마스 Tuschl, RNA 분자 생물학 실험실의 머리 뿐만 아니라 그들의 지원에 대 한와 그의 실험실에 RNAworld 파이프라인에 대 한 액세스를 제공 하는 개발 된 기술을 공유 하기 위한 그의 실험실의 구성원 감사. 우리는 또한 그의 프로토콜을 공유 하 고 그의 초기 절차에 사용 된 모든 생화학 및 효소 단계에 자세한 설명을 제공 하 박사 마르쿠스 Hafner 감사 합니다.

1입니다. 모든 시 약 및 뇌관의 준비
<ol><li>그림 1에 설명 된 대로 모든 뇌관 및 어댑터를 주문.</li>
	<li>
준비는 교정기 칵테일 주식 각 개별 결 찰에 아군 것입니다.
	<ol>
<li>RNase 무료 물 0.5 µ m 캐리어 oligonucleotide (그림 1) resuspend 0.5 µ M 캐리어 oligonucleotide 솔루션을 사용 하 여 100 µ m 10 교정기 oligonucleotides (그림 1) resus...

<ol>
	<li>Peir&#243;-Chova, L., Pe&#241;a-Chilet, M., L&#243;pez-, J. A., Garc&#237;a-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality.">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li><li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excavation+of+a+buried+treasure--DNA,+mRNA,+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed,+paraffin+embedded+tissues.">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li><li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues:+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients.">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).</li><li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity.">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li><li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues.">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li><li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples.">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li><li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues.">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517 (2013).</li><li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues.">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).</li><li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li><li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR:+the+strengths+and+pitfalls.">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li><li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR.">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li><li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays.">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144 (2011).</li><li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples.">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li><li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue:+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance.">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li><li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+and+cancer.">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li><li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis,+prognosis+and+targets+for+therapy.">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li><li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies.">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500 (2011).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li><li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens.">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).</li><li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+DNA/RNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs,+mRNAs,+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens.">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).</li><li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailovi&#263;, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing.">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li><li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing,+selection,+extension+and+ligation+platform:+assessing+its+performance+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma.">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li></ol>

NGS FFPE RNA 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의에 대 한 높은 재현성 및 강력한 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 Hafner 외. 에 의해 설명 하는 절차의 수정 하 고 최적화 된 버전은이 프로토콜에서 제공 됩니다. 22
이 프로토콜의 모든 단계는 FFPE 표본에서 발견 이전 보관 및 손상 된 총 RNA와 함께 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 FFPE RNA의 적은 양?...

miRNAs는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 표본1,2,3에 너무나 잘 보존 된다. 이러한 짧은 규제 비 코딩 단일 좌초 RNA 분자의 표현을 FFPE 샘플에서 총 RNA를 사용 하 여 성공적으로 평가할 수 있다 고 관련 유전자 표현 데이터 원본 신선한에 비해 제공 이전 작품 시연 하고있다 조직4,,56,7,8. 비판적으로 FFPE 조직 처리 (포름알데히드, 열, 건조, 등), 내 생 RNases miRNAs (~ 18-24의 작은 크기는 견본의 나이 의해 영향을 받을 수 표시 된 큰 크기 메신저 RNAs에 비교 될 때 뉴클레오티드) 저하 방지 및 장기 저장, 보관 된 표본9의 높은 처리량 mRNA 연구를 능가할 미르 식 연구를 통해 증명 또한 탄력 있도록 나타납니다. miRNA 식 연구 주로 소규모 분석에서 수행 되었습니다, 보관 된 임상 견본을 사용 하 여 해당 단일 증명 또는 다중화 정량 PCR 분석 실험, microarray 기술, 그리고 가장 최근 NGS의 종류 수 있습니다. 이 분석 실험10,,1112,,1314의 최적화 후 보존 된 miRNAs의 식을 평가 하기 위해 사용.
그것은 명백한 되고있다 dysregulation 미르 식의 다양 한 인간 악성의 개발과 관련 된 되었습니다 하 고 보관 된 표본 주석는 잠재적으로 거 대 한 공급의 임상,을이 작은 RNA 분자는 잠재적인 암 바이오 마커의15,16,,1718의 유망한 소스를 나타냅니다. NGS 같은 높은 처리량 유전자 표현 기술의 사용 PCR 그리고/또한 microarrays19등 대상된 기술에 비교 될 때 모든 miRNA 성적표의 글로벌 평가 제공의 이점이 있다. 이러한 이유로, NGS 위한 이전 보관 된 표본에서 작은 RNAs의 cDNA 라이브러리 준비를 위한 최적화 된, 저렴 한 가격, 그리고 쉽게 적용 가능한 프로토콜 대규모 회고전 연구20수 있도록 최적화 되었다.
우리는 이전 우리 현대 상업 키트21을 능가할 수 있는 오래 된 보관 된 표본에서 RNA와 DNA의 별도 복구에 대 한 동시 RNA/DNA 추출 프로토콜을 설립. 시간의 연장된 기간 동안 보관 하는 FFPE 직물에서 총 RNA를이 추출 프로토콜을 사용 하 여, 우리 최대 35 년 동안 임상 표본에서 보존 하는 miRNAs의 NGS 위한 cDNA 라이브러리의 준비를 최적화. 또한, 최근에 출판 된 연구에서 우리가 어디에서 임상 분류 ductal 암에 제자리에 cDNA 라이브러리 (DCIS) 표본 준비, 우리는 표시 된 정량 PCR에 의해 검증 된 차동 표현 된 miRNAs 확인 그 특정 miRNA 표정 변화 DCIS 유방암을 개발 하지 않는 환자에서 DCIS 장애에 비해 유방암에 걸린 환자에서 병 변에서 감지 될 수 있습니다.
고려 상업 키트 작은 RNA cDNA 라이브러리의 준비를 위해, 그들의 중지에 대 한 잠재력의 비용으로 최적화할 수 없습니다 저작권/특허 보호 시 약의 사용, 우리는 이전 게시 된 적응 하기로 실험실 및 키트 무료 3' 바코드 cDNA 라이브러리 준비 위한 프로토콜 FFPE 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의 NGS,22를샘플링 18의 동시 분석을 허용 합니다. 이 프로토콜 FFPE RNA 견본에 적응에 대 한 중요 했다, 시각 및 기술 평가 검문소와 이상적이 고 강력한 단계별 절차를 제공 하 고 손상 된 또는 어려운 다른 소스를 응용 프로그램에 대 한 강한 잠재력을가지고 이용 하 여 RNA 소재. 원래 프로토콜의 적용 형광 (예를 들어, SYBR 골드)와 방사성 레이블된 크기 마커를 대체 하 여 향상 되었습니다 감지 RNA 크기 마커 큰 polyacrylamide 젤에 합자 라이브러리의 선택 사용. 3' 18 개별 FFPE RNA 견본을에 바코드 어댑터의 결 찰 의존이 최적화 된 프로토콜 다음 5' 어댑터 결 찰을 함께 풀링된 리버스-전사, 그리고 파일럿 PCR 분석에 대 한 맞춤형 최종 cDNA의 증폭 높은 처리량 시퀀서에 대규모 PCR 증폭, 정화, 그리고 NGS 이전 도서관.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Triton x-100</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM ATP</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8110G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X dNTPs</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8110G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14M Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O3445I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 nt ladder</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>M-232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mg/ml Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8894-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X Titanium Taq</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>639208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9170-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5424R</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>4054-4537Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppndorf Thermomixer</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>4053-8223Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Breaker Tube 0.5 ml</td>
			<td>IST Engineering Inc,</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jersey-Cote</td>
			<td>LabScientific, Inc</td>
			<td>1188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KcL 2M</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 1M</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge dual rotor personal centrifuge</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers</td>
			<td>Ciore Life Science</td>
			<td>21070010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Defined during order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme PmeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Imager 2.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Imager 2.0 blue light transilluminator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III reverse transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrGold</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0351L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Themocycler with heated lid</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4359659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 1M pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 1M pH8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-833</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrospective microrna sequencing: complementary dna library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded rna specimens

-보관, 임상 분류 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 암 개발의 회고전 분자 연구에 대 한 핵 산을 제공할 수 있습니다. 사용 하 여 나중에 침략 적인 질병을 개발 하는 환자에서 비 침 습 또는 미리 악성 병 변, 진 식 분석 암 위험을 predispose 초기 분자 변경 식별 도움이 됩니다. 그것은 음 핵 산 FFPE 직물에서 발견 한 심각한 물리적 손상과 그들의 분석을 어렵게 하 고 일반적으로 적응된 분석 실험을 요구 한다 화학 수정 받은 설명 하고있다. 그러나 MicroRNAs (miRNAs),, 소규모 클래스를 대표 하는 RNA 분자 ~ 18-24만 까지의 스패닝의 뉴클레오티드, 장기 저장을 견딜 하는 FFPE 샘플에서 성공적으로 분석 된 표시 되었습니다. 여기에서 우리는 3' 바코드 보완 DNA (cDNA) 라이브러리 준비 프로토콜 때 보관 사용 하 여 강력 하 고 매우 재현 될 최근 시연 했다 보관 된 조직에서 추출 하는 작은 RNAs의 분석을 위해 특별히 최적화 된 선물 임상 표본 최대 35 년 저장입니다. 이 라이브러리 준비는 소재의 손상/저하 (최대 18) RNA 샘플 개별 3' 바코드 어댑터와 출혈 하 고 후속 효소 및 생 화 확 적인 준비에 대 한 다음 함께 풀링된 다중 분석을 잘 적응 이전에 분석. 모든 담긴 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지), 크기 관련 선택 및 바코드 작은 RNA 종의 풍부는에 의해 수행 됩니다. 이 cDNA 라이브러리 준비는 파일럿 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 차세대 시퀀싱 (NGS)에 대 한 자료의 최적의 금액을 생산 하는 특정 증폭 주기의 결정 수 분 RNA 입력에 잘 적응. 이 이렇게 최대 35 년 동안 보관 하는 표본에서 저하 FFPE RNA의 사용을 위해 최적화 되었다 고 매우 재현 NGS 데이터를 제공 합니다.

총 18 개별 FFPE RNA 샘플 메서드는 여기에 설명 된 대로 (100 ng 각) 3' adenylated 바코드 oligonucleotide T4 내 고 하룻밤을 별도 튜브에 설정 됩니다. 다음 날, 효소 반응 열 비활성화, 결합, 되며 단일 튜브에 침전. RNA 펠 릿 resuspended와 합자 RNA 분자 15 %polyacrylamide 젤 (페이지), 페이지 젤의 인접 한 우물에 하는 RNA oligonucleotide 크기 마커를 적절 하 게 크기의 3' 바코드를 선택 하는 데 사?...

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Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 표본 인간의 질병의 분자 biomarkers의 귀중 한 소스를 나타냅니다. 여기 우리는 실험실 기반 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜, 처음 신선한 냉동된 RNA로 설계 하 고 최적화 된 조직에서 보관 된 microRNAs 분석 저장 최대 35 년 제시.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...