Name: excyt: a graphical user interface for streamlining analysis of high-dimensional cytometry data
Uploaded: 2019-01-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data at JoVE.com

Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

1. raccolta e preparazione dei dati Cytometry
<ol><li>Inserire tutte le singole macchie in una cartella di se stessi e l'etichetta con il nome di canale (da fluoroforo, non marcatore).</li>
</ol>2. pre-elaborazione & importazione dati
<ol><li>Per mettere in pausa o salvare in tutta questa pipeline di analisi, utilizzare il pulsante Salva area di lavoro in basso a sinistra del programma per salvare l'area di lavoro come un '. MAT' file che successivamente possa essere caricati ...

<ol>
	<li>Benoist, C., Hacohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry,+amped+up.">Flow cytometry, amped up.</a> Science. 332 (6030), 677-678 (2011).</li><li>Ornatsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiparametric+analysis+by+mass+cytometry.">Highly multiparametric analysis by mass cytometry.</a> Journal of immunological methods. 361 (1), 1-20 (2010).</li><li>Tanner, S. 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Qui vi presentiamo ExCYT, un'interfaccia di utente grafica romanzo che esegue algoritmi basati su MATLAB, per semplificare l'analisi dei dati di alto-dimensionali cytometry, permettendo che gli individui senza sfondo di programmazione per implementare le ultime in alto-dimensionali dati algoritmi di analisi. La disponibilità di questo software per la più ampia comunità scientifica permetterà agli scienziati di esplorare i dati di cytometry di flusso in un flusso di lavoro intuitivo e semplice. Attraverso lo svolgimen...

Progressi in citometria a flusso, nonché l'avvento di massa cytometry ha permesso ai medici e scienziati rapidamente identificare e caratterizzare fenotipicamente biologicamente e clinicamente interessanti campioni con nuovi livelli di risoluzione, creando grande insiemi di dati alto-dimensionali che sono informazioni ricchi1,2,3. Mentre i metodi convenzionali per l'analisi dei dati di cytometry di flusso quali gating manuale sono stati più semplici per gli esperimenti dove ci sono alcuni indicatori che tali marcatori hanno popolazioni visivamente percepibile, questo approccio può non riuscire a generare riproducibilità dei risultati quando l'analisi di insiemi di dati più alto-dimensionali o quelli con marcatori che macchia su uno spettro. Ad esempio, in uno studio multi-istituzionale, dove intra-cellulare (ICS) la macchiatura saggi furono eseguiti per valutare la riproducibilità di quantificazione risposte di cellule T antigene-specifiche, nonostante la buona precisione interlaboratorio, analisi, particolarmente gating, presentare una significativa fonte di variabilità4. Inoltre, il processo di gating manualmente popolazione degli interessi, oltre ad essere altamente soggettiva è altamente in termini di tempo e di lavoro ad alta intensità. Tuttavia, il problema di analizzare set di dati di dimensioni elevate in maniera robusta, efficiente e tempestiva non è uno nuovo per la ricerca di scienze. Studi di espressione genica spesso generano insiemi di dati estremamente alto-dimensionali (spesso dell'ordine di centinaia di geni) dove forme manuale di analisi sarebbe semplicemente non fattibile. Al fine di affrontare l'analisi di questi insiemi di dati, c'è stato molto lavoro nello sviluppo di strumenti bioinformatici per analizzare l'espressione genica dei dati5. Questi approcci algoritmici appena sono state recentemente adottati nell'analisi di citometria a dati come il numero di parametri è aumentato e hanno dimostrato di essere prezioso per l'analisi di questi insiemi di dati dimensionali alta6,7.
Nonostante la generazione e l'applicazione di una varietà di algoritmi e pacchetti software che permettono agli scienziati di applicare questi approcci bioinformatici alto-dimensionali ai loro dati di citometria a flusso, queste tecniche analitiche rimangono ancora in gran parte inutilizzate. Mentre ci può essere una varietà di fattori che hanno limitato l'adozione diffusa di questi approcci per citometria a dati8, l'ostacolo principale abbiamo il sospetto in uso di questi approcci dagli scienziati, è una mancanza di conoscenza computazionale. Infatti, molti di questi pacchetti software (cioè, flowCore, flowMeans e OpenCyto) sono scritti per essere implementato in linguaggi di programmazione quali R che ancora richiedono conoscenze di programmazione sostanziali. Pacchetti software come FlowJo hanno trovato il favore fra gli scienziati grazie alla semplicità di utilizzo e 'plug-n-play' natura, nonché la compatibilità con il sistema operativo del PC. Al fine di fornire la varietà di tecniche analitiche accettati e preziosi per la programmazione di sconosciuto scienziato, abbiamo sviluppato ExCYT, un'interfaccia utente grafica (GUI) che può essere facilmente installata su un PC/Mac che tira molte delle più recenti tecniche compresa la riduzione della dimensionalità per visualizzazione intuitiva, una varietà di metodi di clustering citati nella letteratura, con caratteristiche innovative per esplorare l'output di questi algoritmi con trame di alto-dimensionali/cassa d'afflusso heatmaps e romanzo di clustering.
ExCYT è un'interfaccia di utente grafica costruita in MATLAB e pertanto può sia essere eseguito all'interno di MATLAB direttamente o un programma di installazione viene fornito che può essere utilizzato per installare il software su qualsiasi PC/Mac. Il software è disponibile presso https://github.com/sidhomj/ExCYT. Vi presentiamo un protocollo dettagliato su come importare dati, pre-elaborarlo, condurre riduzione di dimensionalità t-SNE, dati del cluster, sorta e filtrare cluster in base alle preferenze dell'utente e visualizzare informazioni sui cluster di interesse via heatmaps e romanzo trame di alto-dimensionali flusso/scatola (Figura 1). Assi in t-SNE trame sono arbitrari e in unità arbitrarie e così come non sempre mostrato nelle figure per semplicità dell'utente dell'interfaccia. La colorazione dei punti dati nel "t-SNE Heatmaps" è dal blu al giallo basato sul segnale del marcatore indicato. In soluzioni di clustering, il colore del punto dati è basato arbitrario il numero di cluster. Tutte le parti del flusso di lavoro possono essere effettuate nel pannello singolo GUI (Figura 2 & tabella 1). Infine, verrà illustrato l'utilizzo di ExCYT sui dati precedentemente pubblicati, esplorare il paesaggio immune di carcinoma renale delle cellule nella letteratura, anche analizzato con metodi simili. Il set di dati campione che abbiamo usato per creare le figure in questo manoscritto unitamente al protocollo sottostante è reperibile in https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875, al momento della registrazione di un account.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Desktop</td>
			<td style="width:95px;">SuperMicro</td>
			<td style="width:119px;">Custom Build</td>
			<td style="width:167px;">Computer used to run analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB</td>
			<td style="width:95px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Software used to develop ExCYT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excyt: a graphical user interface for streamlining analysis of high-dimensional cytometry data

Con l'avvento dei citometri a flusso in grado di misurare un numero crescente di parametri, gli scienziati continuano a sviluppare pannelli più grandi per esplorare fenotipico caratteristiche dei loro campioni cellulari. Tuttavia, questi progressi tecnologici rendimento alto-dimensionali insiemi di dati che sono diventati sempre più difficili da analizzare obiettivamente all'interno dei tradizionali programmi gating basati su manuale. Al fine di meglio analizzare e presentare i dati, gli scienziati collaborano con bioinformatici con competenze in analisi dei dati alto-dimensionali per analizzare i dati di citometria a flusso. Mentre questi metodi hanno dimostrati di essere altamente utile nello studio della citometria a flusso, devono ancora essere incorporato in un pacchetto semplice e facile da usare per gli scienziati che non hanno competenze di programmazione o computazionale. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato ExCYT, una base di MATLAB utente interfaccia grafica (GUI) che semplifica l'analisi dei dati di cytometry di flusso alto-dimensionali implementando comunemente impiegate tecniche analitiche per l'inclusione di dati alto-dimensionali riduzione di dimensionalità di t-SNE, una varietà di metodi di clustering automatizzati e manuali, heatmaps e flusso alto-dimensionali romanzo trame. ExCYT fornisce inoltre opzioni Gate tradizionali delle popolazioni selezionate di interesse per ulteriore t-SNE e analisi, nonché la possibilità di applicare cancelli direttamente su t-SNE appezzamenti di clustering. Il software offre l'ulteriore vantaggio di lavorare con entrambi compensata o non compensata FCS file. Nel caso in cui è richiesta la compensazione post-acquisizione, l'utente può scegliere di fornire il programma in una directory di singole macchie e un campione senza macchia. Il programma rileva eventi positivi in tutti i canali e utilizza questi dati selezionare per calcolare più obiettivamente la matrice di compensazione. In sintesi, ExCYT fornisce una pipeline di analisi completa per prendere la citometria a flusso di dati sotto forma di file di FCS e consentire qualsiasi individuo, indipendentemente dalla formazione computazionale, di utilizzare i più recenti metodi algoritmici nella comprensione dei propri dati.

Al fine di testare l'usabilità di ExCYT, abbiamo analizzato un set di dati a cura pubblicato da Chevrier et al. , intitolato 'An Immune Atlas di chiaro Carcinoma delle cellule renali' dove il gruppo ha condotto analisi CyTOF con un vasto pannello immune su campioni di tumore prelevati da 73 pazienti11. Due pannelli separati, un pannello mieloide e linfoide, sono stati usati per caratterizzare fenotipicamente il microambiente tumorale. L'obiettivo del nost...

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ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

ExCYT è una base di MATLAB utente interfaccia grafica (GUI) che consente agli utenti di analizzare i dati di cytometry di flusso tramite comunemente impiegate tecniche analitiche per alto-dimensionali dati compresa la riduzione della dimensionalità via t-SNE, una varietà di manuali e automatiche clustering di metodi, heatmaps e flusso alto-dimensionali romanzo trame.

ExCYT: Un'interfaccia utente grafica per semplificare l'analisi dei dati Cytometry alto-dimensionali

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biomedico, come la comprensione del fenotipo delle sotto-popolazioni biologicamente rilevanti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente a un individuo senza esperienza di programmazione di analizzare i propri dati di citometria con le più recenti tecniche ad alta dimensione. Per iniziare una pipeline di analisi, selezionare innanzitutto il tipo di citometria e il numero di eventi da campionare dal file.Fare quindi clic su Gate Population, selezionare le popolazioni di celle di interesse e immettere la percentuale di eventi per l'analisi downstream. Selezionare quindi il numero di canali da utilizzare per l'analisi nella casella di riepilogo. Per l'incorporamento stocastico adiacente distribuito a T, o analisi t-SNE, fare clic su t-SNE per iniziare a calcolare il set di dati di dimensionalità ridotta.Una volta calcolato il set, fate clic su Salva immagine TSNE (Save TSNE Image) e nel menu di scelta rapida T-SNE specifico del marcatore selezionare un marcatore specifico di interesse. Apparirà una figura che mostra una rappresentazione della mappa termica del plottaggio t-SNE che può essere salvata per la generazione della figura. Per iniziare l'analisi del clustering, selezionare un'opzione nella casella di riepilogo Metodo cluster e fare clic su Cluster.Per ordinare i cluster in base a un indicatore di interesse, selezionare l'opzione corrispondente appropriata dal menu di scelta rapida Ordina e fare clic su Crescente, Decrescente, per aggiornare l'elenco dei cluster nella casella di riepilogo Cluster. Per impostare un valore di soglia minimo per un determinato cluster su un determinato canale, selezionare un'opzione dal menu di scelta rapida Soglia e impostare una soglia appropriata. Una volta impostata la soglia, fare clic su Aggiungi soglia sopra o Aggiungi sotto soglia per specificare la direzione della soglia e immettere un taglio numerico nella casella Soglia frequenza cluster, nel pannello Filtro cluster, per impostare una soglia minima per la frequenza di un cluster.Per selezionare i cluster per un'ulteriore individualizzazione dell'analisi, selezionare i cluster di interesse nella casella di riepilogo Cluster. Usare il pulsante Seleziona per spostare le opzioni nella casella di riepilogo Analisi cluster. Per creare mappe di calore dei cluster, selezionare i cluster di interesse nella casella di riepilogo Analisi cluster e fare clic sul pulsante HeatMap of Clusters.Per creare un box plot ad alta dimensione o un plottaggio di flusso ad alta dimensione, selezionate i cluster di interesse nella casella di riepilogo Analisi cluster e fate clic su Plot scatola altadimensionale o plottaggio flusso ad alta dimensione per valutare visivamente la distribuzione di determinati canali di vari cluster in tutte le quote. Per visualizzare i cluster nei plottamenti di flusso 2D tradizionali, selezionate la trasformazione e il canale appropriati nel pannello Plottaggio flusso convenzionale e fate clic su Plottaggio flusso convenzionale (Conventional Flow Plot). Qui viene mostrata un'analisi rappresentativa t-SNE delle mappe di calore per vari marcatori all'interno di una tubazione di analisi del pannello mieloide.Utilizzando la rapida implementazione avida all'interno di ExCYT per raggruppare i dati con 100.000 dei vicini più vicini, sono state rivelate 19 sotto-popolazioni di cellule. Il confronto delle mappe di calore originali con i cluster creati da ExCYT ha permesso di identificare cluster simili delle cellule mieloidi tra i due gruppi di dati. L'analisi del pannello linfoide con un approccio di clustering gerarchico più convenzionale e veloce, ha prodotto distribuzioni marcatori simili tramite mappe di calore t-SNE.Inoltre, il raggruppamento dei dati attraverso il clustering gerarchico ha dimostrato cluster simili di cellule linfoidi. In particolare, una popolazione di cellule T regolatorie unica è stata identificata anche attraverso un diagramma di flusso ad alta dimensione. Per valutare rapidamente e quantitativamente le co-associazioni tra marcatori, prima è stato utilizzato un algoritmo di clustering K-means duro per stabilire 5000 cluster sui dati t-SNE bidimensionali.L'espressione mediana di tutti i marcatori di tutti i cluster è stata quindi utilizzata, per creare una mappa termica da questi cluster, consentendo di identificare facilmente le co-associazioni, come la co-associazione di Tim-3, PD-1, CD38 e 4-1BB. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di esplorare i diversi parametri, ad esempio diversi metodi di clustering, per esplorare completamente i dati che si stanno studiando.

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