Name: use of anti-phospho-girdin antibodies to visualize intestinal tuft cells in free-floating mouse jejunum cryosections
Uploaded: 2018-03-21T15:00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections at JoVE.com

हम Naoya ासाी नागोया विश्वविद्यालय में मुक्त-फ्लोटिंग jejunum वर्गों के लिए कम तापमान प्रतिजन है़ के विकास के लिए उपयोगी सुझाव प्रदान करने के लिए धन्यवाद. इस कार्य को वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान में सहायता (KAKENHI) (सी) के लिए 2012 में (JP25460493) और (ख) में 2017 (JP17H04065) जापान सोसायटी से विज्ञान (JSPS) के संवर्धन के लिए समर्थन किया गया था, A-चरणीय अनुदान 2014 में (AS251Z02522Q) और 2015 में (AS262Z00715Q) से जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST), और एक टाकेडा दूरदर्शी अनुसंधान अनुदान 2014 से टाकेडा विज्ञान फाउंडेशन (एमए करने के लिए) ।

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	<li>Kuga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+an+actin-binding+protein+Girdin+specifically+marks+tuft+cells+in+human+and+mouse+gut.">Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut.</a> J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).</li><li>Jarvi, O., Keyrilainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+cellular+structures+of+the+epithelial+invasions+in+the+glandular+stomach+of+mice+caused+by+intramural+application+of+20-methylcholantren.">On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren.</a> Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).</li><li>Enomoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt/PKB+regulates+actin+organization+and+cell+motility+via+Girdin/APE.">Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE.</a> Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).</li><li>Asai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+phenotypes+of+Girdin+germ-line+and+conditional+knockout+mice+indicate+a+crucial+role+for+Girdin+in+the+nestin+lineage.">Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage.</a> Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-mediated+angiogenesis+by+the+Akt/PKB+substrate+Girdin.">Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin.</a> Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Girdin+is+an+intrinsic+regulator+of+neuroblast+chain+migration+in+the+rostral+migratory+stream+of+the+postnatal+brain.">Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain.</a> J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).</li><li>Nahorski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCDC88A+mutations+cause+PEHO-like+syndrome+in+humans+and+mouse.">CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse.</a> Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).</li><li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+the+G+alpha-Interacting+Protein+GIV+Promotes+Activation+of+Phosphoinositide+3-Kinase+During+Cell+Migration.">Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration.</a> Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).</li><li>Omori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Girdin+is+phosphorylated+on+tyrosine+1798+when+associated+with+structures+required+for+migration.">Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration.</a> Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).</li><li>Goto, H., Inagaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+site-+and+phosphorylation+state-specific+antibody.">Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल के लिए प्रोटोकॉल अनुभव के बिना शोधकर्ताओं की अनुमति गुच्छा कोशिकाओं (टीसीएस) के विश्वसनीय चित्र प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया था । इस प्रोटोकॉल तीन महत्वपूर्ण अंक है: 1) साइट का उपयोग करें और फास्फारिलीकरण स्थिति-tyrosine १७९८ (pY1798 एंटीबॉडी) है कि एक विशिष्ट कंपनी से प्राप्त किए गए थे पर मानव girdin phosphorylated के खिलाफ विशेष खरगोश polyclonal एंटीबॉडी ( इंयूनो-जैविक प्रयोगशालाओं = कंपनी एक्स); 2) jejunum के जिलेटिन भरने; और 3) कम तापमान प्रतिजन पुनः प्राप्ति । व्यापक अर्थों में, फास्फारिलीकरण स्थिति विशेष एंटीबॉडी संशोधन के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है-विशेष एंटीबॉडी कि पोस्ट के एक विशिष्ट प्रकार के अनुवाद संशोधन (उदा acetylation, मिथाइल, या फास्फारिलीकरण) पहचान एक विशिष्ट एमिनो एसिड के अवशेषों में प्रोटीन । Omori एट अल. और कंपनी एक्स संयुक्त रूप से phosphorylated पेप्टाइड के साथ immunizing खरगोश द्वारा pY1798 एंटीबॉडी उत्पंन, और जिसके परिणामस्वरूप एंटीबॉडी ठोस का उपयोग कर एक unphosphorylated पेप्टाइड के साथ चरण क्रोमैटोग्राफी है गोटो विधि9निंनलिखित, 10. pY1798 एंटीबॉडी के साथ गहन पुष्टि की थी इन विट्रो फास्फारिलीकरण परख का उपयोग पूर्ण लंबाई मानव girdin अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ/tyrosine १७९८9में एक बिंदु उत्परिवर्तन के बिना/। इसके बाद Kuga एट अल. ने पाया कि कंपनी एक्स से pY1798 एंटीबॉडी आंतों टीसीएस1के एक विशिष्ट और संवेदनशील मार्कर हैं । इस प्रकार, कंपनी एक्स से pY1798 एंटीबॉडी का समावेश इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है ।
जिलेटिन शामिल कोलेजन पशु ऊतकों से निकाली गई है और लंबे समय histochemical cryosections13का उपयोग कर अध्ययन के लिए एंबेड ऊतक नमूनों के लिए इस्तेमाल किया गया है । कम पिघलने बिंदु जिलेटिन, जो 4 डिग्री सेल्सियस पर जिलेटिन की है, लेकिन कमरे के तापमान पर पिघला देता है, के लिए एक तरल अवस्था में जिलेटिन बनाए रखने के लिए आवश्यक गर्मी के प्रतिकूल प्रभावों से बचने के लिए लागू होने लगे14embedding के दौरान. इस प्रोटोकॉल में, कम पिघलने बिंदु जिलेटिन पाउडर से बना जिलेटिन कि 4 डिग्री सेल्सियस पर gelatinizes और आरटी पर पिघला देता है माउस jejunum के अनुप्रस्थ cryosections की आकृति विज्ञान की रक्षा के लिए इस्तेमाल किया गया था । जब इस जिलेटिन को पूरी तरह से jejunum भरने के लिए इस्तेमाल किया गया तो नमूनों को अपरिवर्तनीय gelatinization हासिल करने के लिए फिर formalin-फिक्स्ड कर दिया गया. एल्डिहाइड-युक्त fixatives12द्वारा मास्क किए गए एंटीजन का पर्दाफाश करने के लिए एक प्रभावी तरीका हीट-प्रेरित antigen पुनर्प्राप्ति है । हालांकि, उच्च तापमान (30 मिनट के लिए 95-99 डिग्री सेल्सियस) आमतौर पर आयल वर्गों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल ऊतक की आकृति विज्ञान/ यहाँ हम कम तापमान प्रतिजन है़ उपयोग (3 एच के लिए 50 डिग्री सेल्सियस) कि दोनों प्रतिजन पुनः प्राप्ति और ऊतक आकृति विज्ञान के संरक्षण की अनुमति देता है.
pY1798 एंटीबॉडी टीसीएस न केवल माउस jejunum में लेबल कर सकते हैं, लेकिन यह भी कई अंगों में (पेट, लघ्वान्त्र, बृहदांत्र, और पित्ताशय की थैली) चूहों और मनुष्यों से1. हालांकि, क्योंकि किसी भी ऊतक से स्थिर ऊतकों में pY1798 संकेतों तेजी से नीचा होगा, इस प्रोटोकॉल jejunum लुमेन में formalin इंजेक्शन शामिल हैं (कदम 2.1.15., चित्र 1a2).
वहां मुक्त अस्थाई cryosections की मोटाई के साथ जुड़े सीमाएं हैं । हालांकि पतली cryosections माइक्रोस्कोपी के लिए translucency के मामले में लाभप्रद हो सकता है, पतली इन वर्गों शारीरिक रूप से कमजोर बनाता है । इसके विपरीत, मोटी cryosections शारीरिक रूप से मजबूत कर रहे हैं, लेकिन खंड में कम एंटीबॉडी पारगम्यता है । इस प्रोटोकॉल में 30 µm-मोटे सेक्शन का इस्तेमाल किया गया था जो दोनों शारीरिक रूप से स्थिर थे और एंटीबॉडी को पारगंय । हालांकि इस विधि प्रोटोकॉल में व्यापक अनुभव के बिना शोधकर्ताओं के लिए डिजाइन किया गया था, अगर प्रोटोकॉल असफल हो जाना चाहिए, pY1798/विलिन/DAPI ट्रिपल दाग के समान है कि Kuga एट अल द्वारा इस्तेमाल किया । 1किया जा सकता है । आयल सेक्शन्स के phalloidin के दाग-actin के साथ जुड़ी कठिनाइयों से बचने के लिए यहां तेल का इस्तेमाल नहीं किया गया ।
girdin tyrosine-१७९८ से सटे एमिनो एसिड अनुक्रम के संरक्षण के कारण, pY1798 एंटीबॉडी माउस के अलावा अन्य प्रजातियों में टीसीएस दाग करने के लिए लागू किया जा सकता, चूहे और मानव सहित. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जिलेटिन भरने अंय खोखले अंगों के लिए भी लागू किया जा सकता है । दरअसल, pY1798 या टीसी के अलावा, कम तापमान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के साथ भरने जिलेटिन के संयोजन के लिए कुख्यात "मुश्किल" माउस पेट में epitopes खुलासा करने के लिए उपयोगी हो सकता है, और एक परिणाम के रूप में, कई शोधकर्ताओं के लिए ब्याज की हो सकती है ।
girdin की जैविक भूमिका और टीसीएस में इसके फास्फारिलीकरण की महत्ता स्पष्ट नहीं है. हालांकि, लिन एट अल द्वारा एक अध्ययन । सुझाव दिया कि girdin की tyrosine फास्फारिलीकरण एफ-actin बहुलकीकरण8की उपाधि से सम्बद्ध है । इस बीच, Kuga एट अल । apoptosis उत्प्रेरण (उदा., सिस्प्लैटिन, एक्स-रे विकिरण) के घातक खुराक पाया है कि वे कल्पना के साथ जुड़ा हो सकता है कि माउस छोटी आंत में टीसीएस के सापेक्ष आवृत्ति में एक बड़ी वृद्धि हुई enterocytes से टीसीएस के लिए संभव रूपांतरण, microvilli में girdin के फास्फारिलीकरण के साथ तुल्यकालन में1. इस संभावना को भविष्य में अतिरिक्त जांच की आवश्यकता होगी । तीन समूहों ने हाल ही में परजीवी संक्रमण के बाद टीसी आवृत्ति में तेजी से वृद्धि हुई15,16,17। इस प्रकार, इस मुक्त अस्थाई धुंधला न केवल endoscopically-एकत्र मानव आंत के ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन टीसी संचय भी मानव पेट में परजीवी संक्रमण के निदान में सहायता कर सकता है ।

गुच्छा (टीसीएस) कोशिकाओं गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल epithelia कि शिखर गुच्छा और स्पूल के आकार की सोमा की विशेषता है की मामूली बिखरे हुए घटक है1। हालांकि टीसीएस पहले 19562में वर्णित किया गया था, टीसी समारोह स्पष्ट नहीं है, आंशिक रूप से विश्वसनीय टीसी मार्करों की कमी के कारण ।
Enomoto एट अल. पहले actin बाध्यकारी प्रोटीन girdin3है, जो तंत्रिका तंत्र में व्यक्त की है, साथ ही साथ गैर में तंत्रिका ऊतकों जैसे रक्त वाहिकाओं, हृदय वाल्व, tendons, और कंकाल की मांसपेशी4विशेषता । girdin के आनुवंशिक पृथक के साथ चूहों विकास मंदता और एकाधिक मस्तिष्क विसंगतियों4,5,6प्रदर्शन । इस बीच, मानव girdin में हानि-समारोह उत्परिवर्तन प्रगतिशील encephalopathy, गंभीर मंदता, और जल्दी शुरुआत मिरगी बरामदगी7के साथ जुड़ा हुआ है ।
2011 में, लिन एट अल. tyrosine १७९८ में girdin के गतिशील फास्फारिलीकरण की पहचान की tyrosine kinases द्वारा मध्यस्थता जैसे EGFR और Src8। उंहोंने यह भी पता चला है कि phosphorylated girdin के लिए आवश्यक है actin पुनर्मॉडलिंग के लिए सेल माइग्रेशन8ट्रिगर । Omori एट अल. विकसित साइट और फास्फारिलीकरण स्थिति-tyrosine १७९८ (pY1798 एंटीबॉडी) पर मानव girdin phosphorylated के खिलाफ विशेष एंटीबॉडी है गोटो प्रोटोकॉल के बाद, और साइट का उपयोग कर एंटीबॉडी मान्य-mutagenesis का निर्देश पूर्ण लंबाई girdin9,10ले जाने की अभिव्यक्ति वैक्टर । 2017 में, Kuga एट अल. रिपोर्ट है कि उच्च विशिष्टता और उच्च संवेदनशीलता के साथ pY1798 लेबल टीसीएस1। pY1798 एंटीबॉडी के लिए पिछले टीसी मार्करों के लिए बेहतर दिखाया गया है उत्कृष्ट धुंधला गुण है कि पूरे सेल आकार से पता चला, लुमेन पर ' विशेषता गुच्छा ' सहित, अभी तक girdin और phospho की जैविक भूमिका-तृकां में girdin समारोह अस्पष्ट1रहे ।
इस अध्ययन में वर्णित विधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, एक ऊतकवैज्ञानिक तकनीक एक लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर ऊतक पर एक विशिष्ट प्रोटीन और एक प्रतिदीप्ति-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक के खिलाफ चिह्नित करने के लिए शामिल है एंटीबॉडी. इस विधि का उद्देश्य के लिए उच्च गुणवत्ता टीसी छवियों को प्राप्त करने के लिए सीमित ऊतकवैज्ञानिक अनुभव के साथ शोधकर्ताओं की अनुमति है । यह प्रोटोकॉल मुक्त-फ़्लोटिंग cryosections का उपयोग करता है जो स्लाइड-माउंटेड cryosections, या आयल अनुभाग की आवश्यकता से बचें । हालांकि, मुक्त अस्थायी वर्गों एक गिलास स्लाइड से समर्थन के अभाव के कारण नाजुक हैं और अनुभाग मोटाई एंटीबॉडी पारगम्यता को कम कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल दो दृष्टिकोण है कि इन मुद्दों पर काबू पाने के: 1) जिलेटिन के साथ पूरे jejunum लुमेन भरने के लिए धुंधला प्रक्रियाओं भर में मुक्त अस्थाई वर्गों की आकृति विज्ञान की रक्षा, और 2) कम तापमान प्रतिजन का उपयोग करने के लिए है़ pY1798 संकेतों को तेज.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Slc:DDY 6-week-old female mice</td>
			<td>Chubu Kagaku Shizai</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>199-02825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>199-10665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100,&#160; Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether</td>
			<td>Katayama Chemical</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>190-00013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% buffered neutral formalin solution</td>
			<td>Muto Chemical</td>
			<td>20215</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21915-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N.N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13015-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-gauge stainless steel straight needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun</td>
			<td>Kono Seisakusho</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gauge winged needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SV-22DLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL TERUMO syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-20ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Iwaki centrifuge tubes</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>2325-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro test tube</td>
			<td>Star</td>
			<td>RSV-MTT1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder, Gelare-blanc</td>
			<td>Nitta Biolab</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece</td>
			<td>Sakura FineTech</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm)</td>
			<td>Shoei Work&#39;s</td>
			<td>1101-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26404-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Block</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Blocking solution in 4.2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X</td>
			<td>28143</td>
			<td>Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>C022221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS-coated slide glass white</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>MI-MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden Mappe KO-type</td>
			<td>Shoei Work&#39;s</td>
			<td>99-40007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801, F123600, F123601, F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water production system</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>GS-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic glove, Star Nitrile Glove</td>
			<td>Star</td>
			<td>RSU-NGVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer, SANYO Ultra Low</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MDF-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Showcase refrigerator</td>
			<td>Nihon Freezer</td>
			<td>NC-ME50EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>0068750-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>HB-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation chamber for immunostaining</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>NR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C)</td>
			<td>Tokyo Rika Kikai</td>
			<td>MMS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope (for tissue handling)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope (for Figure 1B)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (for Figure 3)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of anti-phospho-girdin antibodies to visualize intestinal tuft cells in free-floating mouse jejunum cryosections

actin बाइंडिंग प्रोटीन girdin एक cytosolic प्रोटीन होता है जो कि विभिन्न ऊतकों में सेल माइग्रेशन को ट्रिगर करने के लिए actin रिमॉडलिंग के लिए आवश्यक होता है । Girdin tyrosine १७९८ पर रिसेप्टर और गैर रिसेप्टर tyrosine kinases दोनों द्वारा phosphorylated है. Omori एट अल. विकसित साइट-और tyrosine-१७९८ (pY1798) पर मानव girdin के खिलाफ फास्फारिलीकरण स्थिति विशिष्ट एंटीबॉडी, जो विशेष रूप से phosphorylated tyrosine-१७९८ के लिए बाध्य है, लेकिन unphosphorylated tyrosine-१७९८ के लिए नहीं । pY1798 एंटीबॉडी विशेष रूप से गुच्छा कोशिकाओं (टीसीएस) कि स्तनधारी जठरांत्र ऊतकों में मौजूद हैं लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन इन कोशिकाओं के समारोह स्पष्ट नहीं है. इस प्रोटोकॉल pY1798 एंटीबॉडी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर jejunum में टीसीएस के मजबूत दृश्य की अनुमति देता है । सफल और सरल टीसी विज़ुअलाइज़ेशन सुनिश्चित करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में दो ऊतकवैज्ञानिक तकनीक शामिल हैं: जिलेटिन से भरी jejunum ऊतक से मुक्त अस्थाई cryosections का उत्पादन, और कम तापमान प्रतिजन है़ 50 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए jejunum भरना जिलेटिन, धुंधला प्रक्रिया भर में मुक्त अस्थाई वर्गों के आकार का कहना है, जबकि कम तापमान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति टीसीएस से मजबूत संकेतों को सुनिश्चित करता है । इस प्रोटोकॉल के सफल प्रयोग टीसीएस के अंकुर टिप से वितरित की pY1798 धुंधला में परिणाम तहखाना. सना हुआ टीसीएस एक स्पूल के आकार का सोमा और फ्लोरोसेंट है, जो ' फैलाने गुच्छा से मेल खाती है लुमेन टिप पर गाढ़ा संकेत है । Phalloidin pY1798 के साथ धुंधला colocalized-सकारात्मक टीसीएस में अधिक मोटा ब्रश सीमा पर, और एक rootlet तृकां गुच्छा से विस्तार जन से मेल खाती है । इस प्रोटोकॉल मानव बायोप्सी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल इंडोस्कोपिक के साथ एकत्र नमूनों में टीसीएस की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, टीसीएस हाल ही में चूहों में परजीवी संक्रमण के बाद जमा करने के लिए सूचित किया गया, सुझाव है कि इस प्रोटोकॉल मानव पेट में परजीवी संक्रमण के निदान के लिए आवेदन कर सकते हैं ।

जिलेटिन-फिलिंग ऑफ द jejunum
जिलेटिन के साथ माउस jejunum भरने के लिए एक ठेठ प्रक्रिया दिखाया गया है (चित्र 1a), के रूप में जिलेटिन भरने के लाभ (चित्र 1b) हैं । संक्षेप में, एक 18 गेज सीधे सुई के बेवल टिप पेट की दीवार भेदी के खिलाफ की रक्षा के लिए हटा दिया गया था (चित्र 1a1). जिलेटिन भरने के 10% का उपयोग कर प्राप्त किया गया था तटस्थ formalin समाधान एक कतरनी jejunum खंड के एक छोर से आंतों फ्लश करने के लिए इंजेक्शन और आंत लुमेन सतह को ठीक करने के लिए (चित्र 1a2) तरल जिलेटिन के साथ भरने से पहले ( चित्रा 1a3). जिसके परिणामस्वरूप सॉसेज की तरह टुकड़े (आंकड़ा 1a4) एंबेडेड, जमे हुए थे, और transversely एक cryostat में 30 µm-मोटी स्लाइस में खोदी । जिलेटिन भरने के अभाव में, jejunal वर्गों गुत्थी करने के लिए करते हैं, विल्ली पिछड़े स्विंग करने की अनुमति (आंकड़ा 1b, छोड़ दिया) । जिलेटिन भरने वर्गों के दौर डिस्क आकार को बरकरार रखता है और विल्ली की ईमानदार स्थिति का कहना है (आंकड़ा 1b, सही) । छवियों को स्पष्ट रूप से मुक्त अस्थायी jejunum वर्गों की आकृति विज्ञान के संरक्षण में जिलेटिन भरने से afforded लाभ का संकेत है ।
आंतों गुच्छा कोशिकाओं के सफल इमेजिंग
pY1798 एंटीबॉडी चर immunostaining तकनीक के लिए लागू किया जा सकता है, डॉट सोख्ता सहित, पश्चिमी सोख्ता, आयल अनुभाग धुंधला, गल-घुड़सवार cryosection धुंधला, या मुक्त-फ्लोटिंग cryosection धुंधला1,9. इस प्रोटोकॉल में, हम माउस jejunum में टीसीएस के प्रतिदीप्ति धुंधला के लिए नि: शुल्क-फ्लोटिंग cryosections पर ध्यान केंद्रित pY1798 एंटीबॉडी, phalloidin, और DAPI टीसीएस के संरचनात्मक विशेषताओं का प्रदर्शन करने के लिए1का उपयोग दाग । सामांय में, टीसीएस अंकुर टिप से लगभग एक टीसी/100 उपकला कोशिकाओं की दर से तहखाना1में बिखरे हुए हैं । प्रतिनिधि परिणाम बताते है कि pY1798 reproducibly रूपरेखा बनाती पूरे टीसीएस, झिल्ली सहित, स्पूल के आकार का कोशिका द्रव्य सोमा, और दृढ़ता से सना हुआ लुमेन टिप, जहां मजबूत संकेत संघनित्र ' एक टीसी 1 के फैला हुआ गुच्छा ' से मेल खाती है (चित्रा 2a-बी)। इस बीच, phalloidin एक phallotoxin, एक परिवार के जहरीले bicyclic heptapeptides से मशरूम की Amanita phalloidesहै, और रेशा actin (एफ actin) के लिए उच्च समानता है, जो microvilli में मौजूद है कि आंत्र ब्रश सीमा फार्म 11. Phalloidin reproducibly और प्रमुखता से अधिक मोटा ब्रश सीमा है कि rootlets के एक जन से मेल खाती है1गुच्छा से विस्तार के निशान । इस प्रकार, pY1798 संकेतों के अनुरूप सह स्थानीयकरण (स्पूल के आकार का सोमा, लुमेन टिप पर संकेत संघनित्र) प्रमुखता से अधिक मोटा phalloidin के साथ-सकारात्मक ब्रश सीमा दर्शाता है कि इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक टीसीएस की परवाह किए बिना की पहचान चाहे वे किसी अंकुर (चित्र 2a) पर या एक तहखाना (चित्र b)में स्थित हों.
कम तापमान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति मुक्त अस्थायी वर्गों दाग के लिए प्रभावी है
95-99 ° c पर हीट-आधारित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति व्यापक रूप से आयल वर्गों और स्लाइड घुड़सवार cryosections के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, क्षति के कारण के बिना मुक्त-फ़्लोटिंग अनुभागों के लिए यह प्रकिया लागू करना कठिन है क्योंकि ऐसे अनुभाग स्लाइड-माउंटेड अनुभागों की तुलना में सामांयत: अधिक नाजुक होते है जो12द्वारा समर्थित हैं । के बाद से कम तापमान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति (50 ° c 3 ज के लिए) एक जल स्नान का उपयोग कर प्रारंभिक प्रयोगों में मुक्त अस्थाई jejunum वर्गों की आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं किया, हम एक अंधे परीक्षण में प्रतिजन पुनः प्राप्ति के उद्देश्य प्रभावशीलता का मूल्यांकन, जो सांख्यिकीय कम तापमान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति (चित्रा 3)की प्रभावशीलता की पुष्टि की ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig1.jpg"> चित्रा 1: cryosections के रूपात्मक संरक्षण के लिए jejunum वर्गों के जिलेटिन भरने (क) जिलेटिन के साथ माउस jejunum के भरने intraluminal के लिए प्रक्रियाओं की तस्वीरें । (A1) एक 18 गेज सीधे सुई के बेवल टिप आंत की दीवार भेदी से बचने के लिए हटा दिया गया था । (A2) buffered तटस्थ formalin समाधान (10%) काटा jejunum के एक छोर में इंजेक्शन के लिए आंतों की सामग्री फ्लश और आंत लुमेन सतह को ठीक कर रहा था । (A3) काटा jejunum तरल जिलेटिन से भरा हुआ है और दोनों एक 6-0 नायलॉन टांका (काले तीर)का उपयोग ligated समाप्त होता है । (A4) चार और टांका समुद्री मील (सफेद तीर) पूर्व के बीच रखा मौजूदा सीवन समुद्री मील (काले तीर) तीन छोटे टुकड़े झुकेंगे । ऊतक तो दो संकेत पदों (सफेद ऐरोहेड)पर तीन सॉसेज टुकड़े की तरह में अलग हो जाएगा । (ख) जिलेटिन के लाभकारी प्रभाव-मुक्त फ्लोटिंग cryosection आकृति विज्ञान पर भरना । जिलेटिन भरने के बिना, वर्गों गुत्थी करने के लिए करते हैं, विल्ली को आसानी से पिछड़े स्विंग (बाएं)की अनुमति; जिलेटिन भरने के साथ, एक 30 µm-मोटी अनुभाग एक डिस्क आकार का कहना है और विल्ली की ईमानदार स्थिति संरक्षित है (सही)। छवियां Nomarski विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट का उपयोग कर फोटो खिंचवाने थे । स्केल बार्स, 1 मिमी. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig1large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig2.jpg"> चित्रा 2: प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति माउस आंत्र गुच्छा कोशिकाओं की छवियां एक अंकुर पर टीसीएस की फोकल प्रतिदीप्ति छवियां (a) या में एक तहखाना (B), मुक्त-फ़्लोटिंग माउस jejunum अनुभागों में girdin phosphorylated के विरुद्ध साइट-विशिष्ट और फास्फारिलीकरण-स्थिति-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ सना हुआ tyrosine १७९८ ( pY1798, हरा, इष्टतम उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 490/525 एनएम), phalloidin (लाल, 590/617 एनएम), 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, नीला, 358/461 एनएम) । कम आवर्धन छवियों (स्केल सलाखों, 50 µm) में सफेद बक्से से घिरा क्षेत्र सही (स्केल सलाखों, 10 µm) पर विस्तारित है । pY1798 एंटीबॉडी reproducibly दाग टीसीएस, स्थान की परवाह किए बिना (एक अंकुर पर (एक), या एक तहखाना में (ख)), लुमेन पर मौजूद धुंधला के साथ (तीर), झिल्ली, और स्पूल के आकार का कोशिका द्रव्य टीसी सोमा. phalloidin धुंधला (ऐरोहेड) में एक प्रमुख रूप से गाढ़ा ब्रश सीमा टीसीएस का एक और विशिष्ट संकेत है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig3.jpg"> चित्रा 3: कम तापमान प्रतिजन है़ pY1798 इम्यूनोफ्लोरेसेंस को बढ़ाता है प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के दो समूहों की तुलना कम तापमान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति की प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए किया गया । मुक्त फ्लोटिंग jejunum वर्गों (30 µm मोटी, n = 13) एक ही जमे हुए ब्लॉक से दो समूहों में विभाजित किया गया है, और प्रत्येक समूह से वर्गों पूरा प्रोटोकॉल या एक ही प्रोटोकॉल कम तापमान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति (चरण 4.2.2) की कमी के बाद दाग थे । धुंधला होने के बाद, अनुभागों को समूह संख्याओं के साथ लेबल की गई व्यक्तिगत स्लाइड पर माउंट किया गया था, और प्रत्येक स्लाइड पर लेबलिंग को मास्किंग टेप से कवर किया गया था । सभी स्लाइड में फेरबदल किया गया, टेप पर नए नंबरों के साथ लेबल, और एक FITC फिल्टर के माध्यम से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया । दृश्यमान pY1798 की कुल गिनती-सकारात्मक टीसीएस प्रत्येक समूह में औसत थे, और एक बार ग्राफ में प्रदर्शित किए गए (मतलब ± मानक विचलन) । दो-पुच्छीय t-परीक्षण दोनों समूहों के बीच औसत गणना के लिए किया गया था । P-0.05 नीचे मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माने गए थे । कम तापमान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति काफी pY1798-इम्यूनोफ्लोरेसेंस की प्रभावशीलता में सुधार हुआ है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

विरोधी phospho-girdin एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए मुक्त-फ्लोटिंग माउस Jejunum Cryosections में आंत्र गुच्छा कोशिकाओं कल्पना

Kuga एट अल. पता चला कि फास्फारिलीकरण-phosphorylated १७९८ (tyrosine) पर actin बाइंडिंग प्रोटीन girdin pY1798 के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी गुच्छा कोशिकाओं (टीसीएस) लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल टीसीएस के मजबूत दृश्य pY1798 एंटीबॉडी के साथ मुक्त-फ्लोटिंग jejunum cryosections के immunofluorescent धुंधला का उपयोग करने की अनुमति देता है ।

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

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Biology

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