Name: use of anti-phospho-girdin antibodies to visualize intestinal tuft cells in free-floating mouse jejunum cryosections
Uploaded: 2018-03-21T15:00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections at JoVE.com

Vi tackar Naoya Asai vid Nagoya University för att ge användbara förslag för utvecklingen av låg temperatur antigen retrieval för friflytande jejunum sektioner. Detta arbete stöddes av Grants-in-Aid för Scientific Research (KAKENHI) (C) 2012 (JP25460493) och (B) i 2017 (JP17H04065) från Japan Society för främjande av vetenskap (JSP), A-steg bidrag 2014 (AS251Z02522Q) och 2015 (AS262Z00715Q) från den Japan Science och Technology Agency (JST) och Takeda visionär forskning bidrag 2014 från Takeda Science Foundation (till M.A.).

Alla metoderna som beskrivs här godkändes av djur vård och användning kommittén av Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center (ansökningsnummer: M-03).
1. förberedelser
<ol><li>Förbereda 10 L fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS): 32.27 g Na2HPO4·12H2O, 4,5 g NaH2PO4·2H2O, 80,0 g NaCl tillsätts med ultrarent vatten till en slutlig volym 10 L. Store lösning vid rumstemperatur (RT).</li>
	<li>Förbereda 200 mL PBS-T: 200 mL PBS från steg 1,1 med 100 µL av polyoxyethylene(10) octylphenyl eter till en slutlig koncentration på 0,05% (VOL:VOL)(2)). Butiken på RT.</li>
	<li>Samtidigt bär skyddshandskar och ögonskydd, förbereda 50 mL 15% sackaros i 10% buffrad neutral formalin lösning: 7,5 g sackaros tillsättas 10% buffrad neutral formalin lösning (Tabell för material) till en slutlig volym 50 ml. Butiken på RT. FÖRSIKTIGHET: Inandning och/eller hud/ögon kontakt med formaldehyd i 10% buffrad neutral formalin lösning kan vara farligt. Hanteras med försiktighet.</li>
	<li>Förbereda 1,5 mL 200 enheter/mL phalloidin fluorescerande färgämne konjugat stamlösning: phalloidin fluorescerande färgämne konjugat (300 enheter i 1 injektionsflaska, frystorkade solids, excitering och utsläpp våglängder: 581 nm och 609 nm, respektive) upphängd i 1,5 mL metanol. Förvaras i mörker vid-20 ° C.</li>
	<li>Förbereda 5 mg / mL 4', 6-diamidin-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI) stamlösning: DAPI 10 mg i 2 mL av N, N-dimetylformamid (DMF). Förvaras i mörker vid-20 ° C.</li>
	<li>Förbereda 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS: 0,5 g BSA, 10 mL PBS. Förvaras vid 4 ° C.</li>
	<li>Ta bort den avfasade spetsen av en 18 gauge rak nål med en tång, och nyp nipped slutet med en pincher i längsgående riktning till tillåter vätska att flöda genom nållumenet (figur 1A1). Obs: Protokollet kan pausas här.</li>
</ol>2. djurens dissektion och isolering av Jejunum
<ol><li>Perfusion fixering av en mus<ol>
<li>Använd handskar och arbeta i ett väl ventilerat utrymme.</li>
		<li>Förbereda en 100 mL-glasbägare, 10% buffrad neutral formalin lösning, kirurgiska verktyg (saxar, pincetter), en metallisk bricka, 6-0 nylon skär suturer, en 18 gauge rak nål tillagad som 1,7, 22 gauge bevingade nål, en 20 mL-spruta.</li>
		<li>Fyll 20 mL 10% buffrad neutral formalin lösning från glasbägaren i 20 mL sprutan och hur nålen 22 gauge bevingade utlopp.</li>
		<li>Förbereda flytande gelatin genom att lägga till 1 g gelatin pulver 20 mL PBS (sista 5% gelatin) i ett 50 mL centrifugrör. Efter blötläggning på RT i 15 min, inkubera vid 50 ° C i ett vattenbad i 15 min utan att skaka.</li>
		<li>Kort vortex, och inkubera vid 50 ° C för en annan 15 min till lös upp gelatinet. Lämna röret på RT fram till användning.</li>
		<li>Avliva en vuxen mus av cervikal dislokation.</li>
		<li>Placera musen från steg 2.1.6 på en metallisk bricka och göra ett litet snitt på huden genom ensiform brosk med kirurgiska verktyg.</li>
		<li>Expandera snitt med båda händerna att exponera regionerna bröstkorg och buk.</li>
		<li>Öppna bukhinnan för att exponera membranet, och öppna sedan membranet på båda sidor.</li>
		<li>Skär bröstkorg buren i främre axillär linje på båda sidor, sedan ta bort bröstkorgens vägg genom att skära i en tvärgående riktning vid position av tymus att exponera hjärtat.</li>
		<li>Gör ett litet snitt på hjärtörat av höger förmak dränera blodet och infoga en 22 gauge bevingade nål i spetsen av vänster kammare. Tryck kolven att BEGJUTA vävnader med 10% buffrad neutral formalin lösning.</li>
		<li>Efter utsätta organ i bäckenet, avskurna i slutet av ändtarmen från anus och separera tarmarna från kroppen genom att skära krös.</li>
		<li>För att isolera jejunum, skär tarmarna vid 4 cm från anal sida av den gastric antrum. Kassera den anal hälften av återstående tunntarmen.</li>
		<li>Klipp av jejunum på mitten för att underlätta spolning förfarandet. Lasten 20 mL 10% buffrad neutral formalin lösning i 20 mL sprutan och hur nålen 18 gauge raka bereddes i steg 1,7 till utlopp.</li>
		<li>Injicera 10% buffrad neutral formalin lösning från ena änden av den klippta jejunum att spola ut tarminnehållet och fixar gut lumen ytan (figur 1A2).</li>
		<li>Tvätta gut lumen genom att injicera PBS som beskrivs i steg 2.1.15.</li>
		<li>Spola flytande gelatin i gut lumen som beskrivs i steg 2.1.15 att ersätta PBS med flytande gelatin.</li>
		<li>Nära ena änden av den klippta jejunum av suturen ligering med en 6-0 nylon skär sutur, fylla i jejunum med flytande gelatin och Stäng den motsatta änden av suturen ligatur (figur 1A3).</li>
		<li>Lägga till fyra suturen knop för att passa en korv-formade jejunum avsnitt till deprimerad-delen av en cryomold (figur 1A4). Obs: För cryomolds med en 20 mm x 25 mm x 5 mm deprimerad avsnitt, ett ~ 20 mm korv-liknande jejunum avsnitt är att föredra.</li>
		<li>Blötlägg vävnader i 50 mL 15% sackaros i 10% buffrad neutral formalin lösning över natten vid 4 ° C. Anmärkning: Se stegen till cryoprotection av sackaros och protein fixering av formalin av gelatin och vävnad. Formalin-gelatinized gelatin smälter inte vid RT, medan icke-fasta gelatinized gelatin vid 4 ° C smälter vid RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fäst frysning av Gelatin-fyllda Jejunum vävnader
<ol><li>Genom att minska jejunum på suturen knutar, erhålls tre korv-liknande jejunum bitar med båda ändarna sammanskrivna (figur 1A4). Justera korv-liknande bitar i en cryomold för tillägg av inbäddning förening för beredning av djupfrysta vävnadsprover.</li>
	<li>Snapin frysa cryomold i isopentan kyls med flytande kväve. Store cryomolds vid-80 ° C Obs: Protokollet kan pausas här.</li>
</ol>4. immunofluorescens av tofs celler använder friflytande kryosnitt
<ol><li>Kryosnitt<ol>
<li>Ställ in både kryostaten kammartemperatur (CT) och objektet temperatur (OT) till-22 ° C. Plats fryst vävnad blockera i en cryomold i kryostatkammaren för minst 15 min.</li>
		<li>Tillsätt 3 mL PBS till en 35 mm kultur maträtt.</li>
		<li>Ta bort blocket fryst vävnad från cryomold och skär blocket i halv med ett rakblad att exponera den tvärgående delen av jejunum. Montera en halv block på en chuck (en kryostaten adapter) avsnitt det skärande planet med rakbladet.</li>
		<li>Avsnitt i gelatin-fyllda jejunum i 30 µm tjocka sektioner. Använda frysta pincett försiktigt överföra avsnitten i 35-mm kultur skålen bereddes i steg 4.1.2 (figur 2Bhöger).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tillämpningen av primära antikroppar<ol>
<li>Tvätta friflytande avsnitten i 35-mm kultur skålen 3 gånger för 5 min varje med 3 mL PBS-T med milda skakningar på en ömsesidig skakapparat (ungefärligt 36 gånger / min).</li>
		<li>Förbereda antigen retrieval lösning: 0,3 mL antigen retrieval lösning koncentrat (Tabell för material) i 2,7 mL av ultrarent vatten. Lägga till 3 mL antigen retrieval lösning till 35 mm kultur skålen som innehåller fritt flytande sektioner.</li>
		<li>Stäng locket, täta gapet mellan skålen och locket med en remsa av vinyltejp och inkubera vid 50 ° C i en hybridisering inkubator för 3 h utan att skaka.</li>
		<li>Ta bort skålen från inkubator och cool på RT i 20 min. Efter avlägsnande av vinyltejp, tvätta avsnitten 3 gånger för 5 min varje med 3 mL i PBS-T och milda skakningar.</li>
		<li>Aspirera PBS-T och tillsätt 5 droppar blockerande lösning (Tabell för material) på avsnitten. Inkubera vid RT i 5 min med milda skakningar.</li>
		<li>Bered den primär antikropp: 495 µL av 5% BSA i PBS med 5 µL av phospho-Y1798 girdin (pY1798) antikroppar (Tabell för material). Tillsätt 500 µL av primär antikropp lösning på avsnitten (blockerande lösningen inte behöver tas bort).</li>
		<li>Placera skålen i en fuktad inkubation kammare och inkubera över natten vid 4 ° C med milda skakningar. Obs: Den natten inkubationen kan utökas till upp till tre nätter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tillämpningen av sekundära antikroppar<ol>
<li>Tvätta avsnitten 3 gånger för 5 min varje i 3 mL i PBS-T med milda skakningar.</li>
		<li>Förbereda utspädda DAPI stamlösning: 2 µL av DAPI stamlösning (steg 1,5), 998 µL av PBS.</li>
		<li>Sekundära antikroppar lösning: 476 µL av 5% BSA i PBS, 10,5 µL utspädda DAPI lösningen, 12,5 µL av phalloidin fluorescerande färgämne konjugat stamlösning, 1 µL get anti-kanin IgG-fluorescerande färgämne konjugat (våglängd: excitation 496 nm, emission 520 nm).</li>
		<li>Efter aspirering av PBS-T, tillämpas den sekundära antikroppar lösningen och inkubera i en ljus-skärmad inkubation kammare vid RT för 30 min med milda skakningar.</li>
		<li>Tvätta avsnitten 3 gånger för 5 min varje med 3 mL i PBS-T och milda skakningar.</li>
		<li>Efter den sista tvättningen, ta den PBS-T och ersätta med 3 mL PBS saknar polyoxyethylene(10) octylphenyl eter. Överföra skålen till en stereoskopisk Mikroskop.</li>
		<li>Plats 200 µL av PBS i en droplet på mitten av ett MAS-belagd vitt glas bild och överföra en jejunum avsnitt från skålen till droplet-programmet använder ett P200 Pipettera tips.</li>
		<li>Efter justering avsnitt justeringen i stereoskopisk Mikroskop, aspirera alla återstående PBS kring avsnittet.</li>
		<li>Tillsätt 20 µL av vattenhaltigt montering media och placera ett 20 x 20 mm täckglas ovanpå media.</li>
		<li>Omedelbart försegla täckglas kanterna med xylen-baserade montering media. Placera bilden på en trä mappe och låt xylen-baserade montering media att stelna på RT för 2-3 h. Obs: Protokollet kan pausas här. Efter xylen-baserade montering media stelnar, kan bilder lagras i 2-3 veckor i en ljus-skärmad bild låda på RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. konfokalmikroskopi
<ol><li>Pålagda 63 X syftet confocal Mikroskop nedsänkning olja. Sänk täckglas-bilden och placera bilden på scenen.</li>
	<li>Digitalisera TC bilderna förvärvat vid laser våglängderna 405, 488 och 555 nm och spara bilder i tiff-format (TIFF). Obs: Välj en upptäckt filter som är lämplig för fluorescens färgämnen (dvs excitation/utsläpp maxima: 358/461 nm, 490/525 och 590/617).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kuga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+an+actin-binding+protein+Girdin+specifically+marks+tuft+cells+in+human+and+mouse+gut.">Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut.</a> J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).</li><li>Jarvi, O., Keyrilainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+cellular+structures+of+the+epithelial+invasions+in+the+glandular+stomach+of+mice+caused+by+intramural+application+of+20-methylcholantren.">On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren.</a> Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).</li><li>Enomoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt/PKB+regulates+actin+organization+and+cell+motility+via+Girdin/APE.">Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE.</a> Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).</li><li>Asai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+phenotypes+of+Girdin+germ-line+and+conditional+knockout+mice+indicate+a+crucial+role+for+Girdin+in+the+nestin+lineage.">Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage.</a> Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-mediated+angiogenesis+by+the+Akt/PKB+substrate+Girdin.">Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin.</a> Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Girdin+is+an+intrinsic+regulator+of+neuroblast+chain+migration+in+the+rostral+migratory+stream+of+the+postnatal+brain.">Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain.</a> J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).</li><li>Nahorski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCDC88A+mutations+cause+PEHO-like+syndrome+in+humans+and+mouse.">CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse.</a> Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).</li><li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+the+G+alpha-Interacting+Protein+GIV+Promotes+Activation+of+Phosphoinositide+3-Kinase+During+Cell+Migration.">Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration.</a> Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).</li><li>Omori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Girdin+is+phosphorylated+on+tyrosine+1798+when+associated+with+structures+required+for+migration.">Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration.</a> Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).</li><li>Goto, H., Inagaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+site-+and+phosphorylation+state-specific+antibody.">Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections.">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li><li>Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embedding+and+sectioning+technique+for+immunohistochemical+studies+of+minute+specimens+of+tissue.">An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue.</a> J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).</li><li>Ushida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-embedding+technique+with+low+melting+temperature+gelatin+for+preparation+of+histological+sections.">Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections.</a> Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li><li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit.">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites.">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Detta protokoll var utformat för att forskare utan histologi erfarenhet att få tillförlitliga bilder av tofs celler (TCs). Detta protokoll har tre kritiska punkter: 1) användning av webbplats- och phosphorylation status-specifika kanin polyklonala antikroppar mot humant girdin fosforyleras på tyrosin 1798 (pY1798 antikroppar) som erhölls från ett visst företag ( Immuno-Biological laboratorier = företag X); (2) gelatin fyllning av jejunum; och 3) låg temperatur antigen retrieval. I vid bemärkelse, phosphorylation status-specifika antikroppar kan kategoriseras som modifiering-specifika antikroppar som känner igen en viss typ av posttranslationella modifieringen (e.g. acetylering, metylering eller fosforylering) av en protein på en specifik aminosyra rester. Omori o.a. och företag X genereras gemensamt pY1798 antikroppar av immuniseringsämnet kaniner med fosforyleras peptid och renande de resulterande antikroppar med fasta fasen kromatografi med en unphosphorylated peptid efter Goto: s metod9, 10. pY1798 antikroppar validerades intensivt med in vitro- fosforylering analyser med fullängds mänskliga girdin uttryck vektorer med/utan en punktmutation på tyrosin 17989. Kuga et al. fann därefter att pY1798 antikroppar från företag X är en specifik och känslig markör för intestinal TCs1. Således, integration av pY1798 antikroppar från företag X är en kritisk punkt i detta protokoll.
Gelatin innehåller kollagen som utvinns från djurvävnader och har länge använts till bädda in vävnadsprover för histochemical studier använder kryosnitt13. Låg--smältpunkt gelatin, som är gelatinized vid 4 ° C men smälter vid rumstemperatur, började tillämpas för att undvika negativa effekter av värme som behövs för att bibehålla gelatin flytande under inbäddning14. I detta protokoll användes låg--smältpunkt gelatin tillverkade av gelatin pulver som gelatinizes vid 4 ° C och smälter vid RT att bevara morfologi av tvärgående kryosnitt av mus jejunum. När denna gelatin användes för att helt fylla i jejunum, var prover sedan formalin-fast att uppnå bestående gelatinization. Värme-inducerad antigen retrieval är en effektiv metod att exponera antigener som maskas av aldehyd-innehållande fixativ12. De höga temperaturer (95-99 ° C i 30 min) som vanligen används för analys av paraffin avsnitt kan dock skada morfologi av vävnad/gelatin komplexa. Här använde vi låg temperatur antigen retrieval (50 ° C för 3 h) som gör att både antigen retrieval och bevarandet av vävnad morfologi.
pY1798 antikroppar kan märka TCs inte bara i mus jejunum, men också i flera organ (mage, ileum, kolon och gallblåsan) från mus och människa1. Men eftersom pY1798 signaler i ofixerade vävnader från alla vävnader försämras snabbt, detta protokoll innehåller formalin injektion i jejunum lumen (steg 2.1.15., figur 1A2).
Det finns begränsningar som är associerade med tjockleken på friflytande kryosnitt. Även om tunna kryosnitt kan vara fördelaktigt när det gäller genomskinlighet för mikroskopi, gör tunnhet dessa avsnitt fysiskt sårbara. Däremot tjock kryosnitt är fysiskt robust, men har lägre antikropp permeabilitet i avsnittet. I detta protokoll, 30 µm tjocka sektioner användes som var både fysiskt stabil och genomsläppliga för antikroppar. Även denna metod var avsedd för forskare utan omfattande erfarenhet i histologi, om protokollet skulle misslyckas, avsnitt pY1798/villin/DAPI trippel färgning av paraffin liknar den som används av Kuga o.a. kunde vara utförda1. Paraffin avsnitt användes inte här att undvika svårigheter i samband med phalloidin färgning av F-aktin i paraffin avsnitt.
På grund av bevarandet av amino syra ordnar intill girdin tyrosin-1798, kan pY1798 antikroppar användas för att färga TCs i andra arter än musen, inklusive råtta och människa. Gelatin fyllningen används i detta protokoll kan också tillämpas för andra ihåliga organ. Faktiskt, bortsett från pY1798 eller TC, kombinationen av gelatin fylla med låg temperatur antigen retrieval kan vara användbara för att avslöja notoriskt ”svåra” epitoper i mus tarmen, och följaktligen kan vara av intresse för många forskare.
Girdin biologiska roll och betydelsen av dess fosforylering i TCs är oklart. Dock en studie av Lin et al. föreslog att tyrosin fosforylering av girdin är associerad med graden av F-aktin polymerisation8. Under tiden, Kuga et al. fann att dödliga doser av apoptos-inducerare (t.ex., cisplatin, röntgenstrålning) orsakade en stor ökning i relativ frekvens av TCs i mus tunntarmen som de hypotetiska kan vara förknippade med den eventuell omvandling från enterocyter till TCs, i synkronisering med phosphorylationen av girdin i Mikrovilli1. Denna möjlighet kommer att kräva ytterligare utredning i framtiden. Tre grupper nyligen observerade snabb ökning TC frekvens efter parasit infektion15,16,17. Således, denna friflytande färgning kan användas inte bara för att analysera endoskopiskt-samlat mänskliga tarmen vävnader, men TC ackumulering kan också stöd i diagnos av parasit infektion i mänskliga tarmen.

Tofs celler (TCs) är mindre spridda delar av gastrointestinala epitel som kännetecknas av apikala knippen och spool-formade somas1. Även om TCs beskrevs först 19562, förblir TC funktionen oklart, delvis på grund av brist på tillförlitliga TC markörer.
Enomoto o.a. först kännetecknas proteinet aktin bindande girdin3, som uttrycks i nervsystemet samt i icke-neurala vävnader såsom blodkärl, hjärtklaffar, senor och skelettmuskulatur4. Möss med genetiska ablation av girdin Visa tillväxthämning och flera hjärnan anomalier4,5,6. Samtidigt är förlust-of-function mutation i mänskliga girdin associerade med progressiv encefalopati, svår utvecklingsstörning och tidigt insättande epileptiska anfall7.
2011 identifierade Lin et al. dynamiska fosforylering av girdin på tyrosin 1798 medieras av tyrosinkinaser såsom EGFR och Src8. De visade också att fosforyleras girdin krävs för aktin remodeling för att utlösa cell migration8. Omori et al. utvecklat webbplatsen - och phosphorylation status-specifika antikroppar mot humant girdin fosforyleras på tyrosin 1798 (pY1798 antikroppar) följande Goto: s protokoll, och validerade antikroppar använder webbplats riktad mutagenes av uttryck vektorer redovisade fullängds girdin9,10. 2017, Kuga o.a. rapporterade att pY1798 etiketter TCs med hög specificitet och hög känslighet1. Antikropparna som pY1798 visat sig vara överlägsna tidigare TC markörer baserat på utmärkta färgning egenskaper som avslöjade formen hela cellen, inklusive karakteristiskt ”tofs” på lumenal spets, ännu biologiska roll girdin och phospho-girdin i TC funktion förblev oklart1.
Den metod som beskrivs i denna studie innebär immunofluorescens färgning, en histologisk teknik för att markera ett specifikt protein på vävnad med hjälp av en primär antikropp mot ett målprotein och en sekundär fluorescens-konjugerad antikropp mot primärt antikropp. Syftet med denna metod är att låta forskare med begränsad histologiska erfarenhet att få bilder av hög kvalitet TC. Detta protokoll används fritt flytande kryosnitt som undviker behovet av slide-monterad kryosnitt, eller paraffin avsnitt. Dock fritt flytande sektioner är bräcklig på grund av avsaknad av stöd från en glasskiva och snittjockleken kan minska antikropp permeabilitet. Detta protokoll innehåller två metoder som övervunnit dessa frågor: 1) fylla hela jejunum lumen med gelatin att bevara morfologi av friflytande sektioner i hela färgning förfarandena, och (2) användning av låg temperatur antigen retrieval till intensifiera pY1798 signaler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Slc:DDY 6-week-old female mice</td>
			<td>Chubu Kagaku Shizai</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>199-02825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>199-10665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100,&#160; Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether</td>
			<td>Katayama Chemical</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>190-00013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% buffered neutral formalin solution</td>
			<td>Muto Chemical</td>
			<td>20215</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21915-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N.N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13015-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-gauge stainless steel straight needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun</td>
			<td>Kono Seisakusho</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gauge winged needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SV-22DLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL TERUMO syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-20ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Iwaki centrifuge tubes</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>2325-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro test tube</td>
			<td>Star</td>
			<td>RSV-MTT1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder, Gelare-blanc</td>
			<td>Nitta Biolab</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece</td>
			<td>Sakura FineTech</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm)</td>
			<td>Shoei Work&#39;s</td>
			<td>1101-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26404-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Block</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Blocking solution in 4.2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X</td>
			<td>28143</td>
			<td>Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>C022221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS-coated slide glass white</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>MI-MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden Mappe KO-type</td>
			<td>Shoei Work&#39;s</td>
			<td>99-40007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801, F123600, F123601, F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water production system</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>GS-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic glove, Star Nitrile Glove</td>
			<td>Star</td>
			<td>RSU-NGVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer, SANYO Ultra Low</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MDF-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Showcase refrigerator</td>
			<td>Nihon Freezer</td>
			<td>NC-ME50EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>0068750-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>HB-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation chamber for immunostaining</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>NR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C)</td>
			<td>Tokyo Rika Kikai</td>
			<td>MMS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope (for tissue handling)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope (for Figure 1B)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (for Figure 3)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of anti-phospho-girdin antibodies to visualize intestinal tuft cells in free-floating mouse jejunum cryosections

Den aktin bindande protein girdin är ett cytosoliskt protein som krävs för aktin remodeling för att utlösa cellmigration i olika vävnader. Girdin är fosforyleras av både receptor och icke-receptor tyrosinkinas på tyrosin 1798. Omori et al. utvecklat webbplats- och phosphorylation status-specifika antikroppar mot mänskliga girdin på tyrosin-1798 (pY1798), som specifikt binder till fosforylerade tyrosin-1798, men inte till unphosphorylated tyrosin-1798. pY1798 antikroppar har använts till specifikt etikett tofs celler (TCs) som finns i däggdjurs mag vävnader, men funktionen av dessa celler är oklart. Detta protokoll tillåter robust visualiseringen av TV-kamerasystem i den jejunum med pY1798 antikroppar och immunofluorescens. För att säkerställa framgångsrika och enkel TC visualisering, detta protokoll omfattar två histologiska tekniker: produktionen av fritt flytande kryosnitt från gelatin-fyllda jejunum vävnad och låg temperatur antigen hämtning vid 50 ° C för 3 h. fyllning av jejunum med gelatin bibehåller formen av friflytande sektioner under hela förfarandet för färgning, låg temperatur antigen retrieval säkerställer robust signaler från TCs. framgångsrik användning av detta protokoll resulterar i pY1798 färgning av TCs distribueras från villus tips till crypt. Färgade TCs har en spool-formade soma och fluorescerande signaler kondensera vid lumenal spets, vilket motsvarar den utskjutande 'tofs.' Phalloidin färgning colocalized med pY1798-positiv TCs vid förtjockad borste gränsen, och motsvarar en rootlet massa sträcker sig från TC tofs. Detta protokoll kan användas för att undersöka TCs i mänskliga biopsi prov som samlats med gastrointestinal endoskop. Dessutom rapporterades TCs nyligen att ackumuleras efter parasit infektion hos möss, vilket tyder på att detta protokoll kan ha program för diagnos av parasitinfektioner i mänskliga tarmen.

Gelatin-fyllning av jejunum
Ett typiskt förfarande för att fylla mus jejunum med gelatin är kartan (figur 1A), fördelarna med gelatin-fyllning (figur 1B). I korthet togs den avfasade spetsen av en 18 gauge rak nål bort för att skydda mot piercing tarmväggen (figur 1A1). Gelatin fyllning uppnås med hjälp av 10% buffrad neutral formalin lösning injiceras från ena änden av en klippt jejunum avsnitt att tömma tarmen och fixar gut lumen ytan (figur 1A2) före fyllning med flytande gelatin ( ) Figur 1A3). Den resulterande korv-liknande bitar (figur 1A4) var inbäddad, fryst och tvären sektioneras till 30 µm tjocka skivor i en kryostaten. I avsaknad av gelatin som fyllning, brukar jejunal sektioner kink, tillåter villina att svänga bakåt (figur 1Bvänster). Gelatin fyllningen bevarar den runda skiva-formen av avsnitten och upprätthåller upprätt positionering av villina (figur 1Bhöger). Bilderna visar tydligt den förmån som ges av gelatin fylla i bevara morfologi av friflytande jejunum sektioner.
Framgångsrika avbildning av intestinal tofs celler
pY1798 antikroppar kan användas för variabel immunfärgning tekniker, inklusive dot blotting, western blotting, paraffin avsnitt färgning, Tina monterade cryosection färgning eller fritt flytande cryosection färgning1,9. I detta protokoll fokuserade vi på friflytande kryosnitt för fluorescens färgning av TV-kamerasystem i mus jejunum med pY1798 antikroppar, phalloidin och DAPI färgning för att påvisa strukturella egenskaperna hos TCs1. I allmänhet är TCs utspridda i en takt av ca en TC/100 epitelceller från villus spets till kryptan1. Representativa resultat visar att pY1798 reproducibly skisserar hela TCs, inklusive membranet, cytoplasman av den spool-formade soma, och starkt färgade lumenal spets, där robust signal kondens motsvarar de utskjutande 'tofs' av en TC1 ()Figur 2A-2B). Samtidigt phalloidin är en phallotoxin, en familj av giftiga bicykliska heptapeptides från svampen Amanita phalloides, och har hög affinitet för fintrådiga aktin (F-aktin), som är närvarande i Mikrovilli som bildar intestinal borste gränsen 11. Phalloidin reproducibly och tydligt markerar förtjockad borste gränsen som motsvarar en massa rottrådar sträcker sig från tofs1. Således, konsekvent samtidig localizationen av pY1798 signaler (spool-formade soma, signal kondens vid lumenal spets) med tydligt förtjockade phalloidin-positiv borste gränsen visar att detta protokoll framgångsrikt identifierar TCs oavsett om de är placerade på en villus ()figur 2A) eller i en krypta ()figur 2B).
Låg temperatur antigen retrieval är effektivt för färgning friflytande sektioner
Värme-baserade antigen retrieval 95-99 ° c används ofta för analys av paraffin avsnitt och slide-monterad kryosnitt. Tillämpa denna strategi till friflytande avsnitt utan att orsaka skador är dock svårt eftersom sådana sektioner är generellt mer ömtålig än bild monterade sektioner som stöds av den bild12. Sedan låg temperatur antigen retrieval (50 ° C för 3 h) använder ett vattenbad påverkade inte morfologi friflytande jejunum avsnitt i preliminära experiment, vi utvärderat objektiva effektiviteten av antigen retrieval i en blind test, som statistiskt bekräftade effektiviteten av låg temperatur antigen retrieval ()figur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig1.jpg"> Figur 1: Gelatin fyllning av jejunum sektioner för morfologiska bevarandet av kryosnitt (A) fotografier av förfaranden för intraluminal fyllning av mus jejunum med gelatin. (A1) Den avfasade spetsen av en 18 gauge rak nål har tagits bort för att undvika piercing tarmväggen. (A2) Neutral buffrad formalin lösning (10%) injicerades i ena änden av den klippta jejunum att spola tarminnehållet och fixa gut lumen ytan. (A3) Klippta jejunum fylld med flytande gelatin och båda ändarna sammanskrivna använder en 6-0 nylon sutur (svarta pilar). (A4) Fyra mer suturen knop (vita pilar) placeras mellan redan existerande suturen knop (svarta pilar) gav tre kortare stycken. Vävnaden sedan separeras i tre korv-liknande bitar på två angivna positioner (vit pilspetsar). (B) positiva effekter av gelatin-fyllning på fritt flytande cryosection morfologi. Utan gelatin fyllning tenderar avsnitt att kink, tillåter villina enkelt svänga bakåt (vänster); med gelatin fyllning, en 30 µm tjock avsnitt upprätthåller en skiva form och villina upprätt ställning är bevarade (höger). Bilderna har fotograferats med hjälp av Nomarski differential störningar kontrast. Skala barer, 1 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig2.jpg"> Figur 2: Representativa fluorescens bilder av mus intestinal tofs celler Confocal fluorescens bilder av TV-kamerasystem på en villus (A) eller i en krypta (B), i fritt flytande mus jejunum sektioner fläckade med platsspecifika och fosforylering-status-specifika antikroppar mot girdin fosforyleras på tyrosin () 1798 pY1798, grön, optimal excitation/utsläpp våglängder 490/525 nm), phalloidin (röd, 590/617 nm), 4,6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, blå, 358/461 nm). Området omges av vita lådor i låg förstoring bilder (skala barer, 50 µm) utökas till höger (skala barer, 10 µm). pY1798 antikroppar fläcken reproducibly TCs, oavsett läge (på en villus (A), eller i en krypta (B)), med färgning närvarande vid den lumenal tip (pilar), membran och cytoplasman i de spool-formade TC soma. En tydligt förtjockade borste gränsen i phalloidin färgning (pilspetsar) är en annan utmärkande tecken på TCs. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig3.jpg"> Figur 3: Låg temperatur antigen retrieval förbättrar pY1798 immunofluorescens Två grupper av experimentella rutiner jämfördes för att bekräfta effekten av låg temperatur antigen retrieval. Friflytande jejunum sektioner (30 µm tjock, n = 13) från en enda frysta block delades in i två grupper, och sektioner från varje grupp var målat efter komplett protokollet eller samma protokoll saknas låg temperatur antigen retrieval (steg 4.2.2). Efter färgning, avsnitt var monterade på enskilda bilder märkta med gruppnummer och märkning på varje bild var täckt med maskeringstejp. Alla bilder var blandade, märkt med nya nummer på bandet och observerat under fluorescensmikroskopi genom ett FITC-filter. Totala antalet synliga pY1798-positiv TCs var i genomsnitt i varje grupp, och visades i ett stapeldiagram (medelvärde ± standardavvikelse). Ett tvåsidiga t-test utfördes för att jämföra den genomsnittliga räknas mellan de två grupperna. P-värden under 0.05 ansågs statistiskt signifikant. Låg temperatur antigen retrieval avsevärt förbättrat effektiviteten i pY1798-immunofluorescens. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections at JoVE.com

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

Användning av Anti-phospho-girdin antikroppar att visualisera Intestinal tofs celler i friflytande mus Jejunum kryosnitt

Kuga et al. upptäckte att fosforylering-status specifika antikroppar mot den aktin bindande protein girdin fosforyleras på tyrosin 1798 (pY1798) kan användas för att märka tofs celler (TCs). Detta protokoll kan robust visualisering av TV-kamerasystem med Immunofluorescerande färgning av friflytande jejunum kryosnitt med pY1798 antikroppar.

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

En teknik för att samtidigt Visualisera Virus-Särskilda CD8 + T-celler och virusinfekterade celler In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Analys av pluripotenta stamceller genom att använda kryosnitt av Embryoid organ

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Användning av LysoTracker att upptäcka programmerad celldöd i embryon och Skilja embryonala stamceller

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Användning av Time Lapse mikroskopi för att visualisera Anoxia-inducerad skendöd i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryon

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analys av Metabolic profil i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mouse Intestinal Crypt organoid kulturer

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...