تم تمويل هذا العمل من مجلس "البحوث الألمانية" (DFG) من خلال مبادرة التفوق الألماني (سيلنيتوركس DFG-EXC 81)، وتمويل جزئي بمركز البحوث التعاونية SFB638.

<ol>
	<li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules,+big+targets:+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge.">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging.">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling.">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes.">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li><li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation.">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li><li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes.">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li><li>B&#233;thune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells.">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci.">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing.">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li><li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex.">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Asc1p/Receptor+for+Activated+C+Kinase+1+(RACK1)+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast.">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li><li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity.">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSITe:+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation.">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins.">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li><li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs.">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li><li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID:+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions.">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+TurboID+for+efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms.">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يصف الإجراء المبين كيفية استنساخ جينات فائدة في سبليت-بيويد البلازميدات وكيفية اختبار بيوتينيليشن الناجمة عن التفاعل وكيفية عزل البروتينات بيوتينيلاتيد لتحليل الطيف الكتلي. يصف لنا هنا إجراء يستند تعداء عابرة. في حين يمكن ضبطها على التعبير عن البروتينات الانصهار بمقدار دوكس إضافة إلى المتوسط، تعداء عابر قد يؤدي إلى التعبير البروتين غير متجانسة مع بعض الخلايا بشكل صارخ أوفيريكسبريس البروتينات الانصهار إذا ما قورنت الذاتية النظراء. وهذا قد يؤدي إلى تشوهات إينتيراكتوميس المقابلة وإلى PPI التي لا تعكس بدقة التفاعلات التي تنطوي على البروتينات الذاتية. وهكذا يستحسن عموما لتشييد خطوط الخلايا مستقرة بعد إثبات سبليت-بيويد مع نظام عابر. والبلازميدات متوافقة مع نظام اقترانها بوساطة حزب العمل الفيجي وكلا الجينات الفائدة بموجب اللائحة من نفس العنصر تيت المراعية. إذا لزم الأمر، وعند استخدامها مع خلايا الثدييات متوافقة، أنها تسمح بإنشاء خطوط الخلايا إيندوسيبلي مستقرة سهلة. على سبيل المثال، نحن نستخدم الخط هيلا-EM2-11 الذي يعبر عن المنشط المنشط التتراسيكلين النسخ رتا وموضع الجينوم استهدافها فريد الذي يمكن أن يكون التعبير الجيني بوساطة التتراسيكلين محكم التنظيم12. استخدام هذا الخط الخليوي واقترانها بوساطة حزب العمل الفيجي، يمكن الحصول على خطوط الخلية المستقرة التي تحتوي على نسخة واحدة فقط من التحوير غضون أسبوعين-ثلاثة أسابيع. بدلاً من ذلك، واحد يمكن أيضا استخدام تقنيات التحرير الجينوم الحالي ﻹدخال البيرا * الشظايا في المكاني الجينوم الأصلي للجينات للفائدة.
كما هو الحال في أي تحليل يعتمد على علامات بروتين، يحتاج المرء للنظر إذا كان الانصهار البروتينات الناتجة وظيفية. اختبار البيانات المتاحة التي كانت معلم البروتينات للفائدة (على سبيل المثال مع التجارة والنقل للتصوير الدراسات) ووظيفيا مفيداً أن يقرر إذا كان ينبغي أن تكون الشظايا البيرا * المستنسخة المنبع أو المصب الجينات للفائدة. إذا كان لا من هذه البيانات متاحة، ينبغي اختبار واحد ن لا شفاء منه أو ج-شفاء معلم البروتينات في مقايسة وظيفية. على سبيل المثال، يمكن اختبار نشاط البروتينات الانصهار في خط خلية التي البروتين الذاتية تم طرقت السحب ومقارنة بالحالة نوع البرية. إذا تحمل البروتينات التي تهم كلا الطرفي ن وج العلامات، على حد سواء وينبغي اختبار. التوجه للبروتين الانصهار في تجارب بيويد، في الواقع، يمكن أن تؤثر كفاءة وسم22. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد لاحظنا أنه عند تطبيق انقسام-بيويد على زوج من البروتينات، التي من البروتينات هما يتم إلحاق إلى أما نبيرا * أو كبيرى * تجزئ أيضا تأثير كفاءة وسم9. في والبلازميدات سبليت--بيويد، 16 من الأحماض الأمينية طويلة جليكاين/سيرين linkers الغنية اقتران البروتينات ذات الاهتمام للشظايا البيرا * أخذت من آخر محكمة التحكيم الدائمة23 وعملت لنا لجميع البروتينات المتفاعلة اختبرناها حتى الآن. ومع ذلك، ينبغي النظر أن بعض أزواج البروتين قد تعمل على نحو أفضل مع linkers أقصر أو أطول. ووصف المجموعة بولين24من ملاحظة أخيرة، مقايسة أخرى. في هذا التحليل، البيرا * يتم تقسيم في موقع آخر (e140 من/Q141) من بلدنا (E256/G257). لدينا اختبار كلا سبليت-بيويد النكهات-جنب ووجدت أن E256/G257، المبينة في هذا البروتوكول، ويؤدي إلى إعادة تنشيط أقوى عندما يقترن باثنين من البروتينات المتفاعلة9.
عيب عام واحد من هذا الأسلوب هو بطء وضع العلامات. نموذجياً، ح 6 إلى 24 حضانة الوقت مع البيوتين من الضروري الحصول على بيوتينيليشن ملموس6، النافية لاستخدام هذا الأسلوب لدراسة إعادة عرض ديناميكية من البروتين المجمعات. بينما هذا التحليل يتناول جزئيا هذا التحذير كما يتم تفعيلها فقط عندما تتفاعل البروتينات اثنين، بطء وسم يحول دون استخدامها لدراسة استجابة للعمليات الحيوية جداً، أو لتحليل البروتينات لم تدم طويلاً. البيروكسيديز هندسيا المعروف APEX2 لتعزيز كفاءة وسم البروتينات الدانية داخل 1 دقيقة3. قد تعالج محكمة التحكيم الدائمة استناداً إلى APEX2 وبذلك القيود المفروضة على بطء وضع العلامات لفحوصات المستمدة من بيويد. ووصف دراسة إثبات لمبدأ هذه تقسيم APEX2 مقايسة25. ومع ذلك، رغم بروتين هوموديميريزينج تمت بنجاح بيوتينيلاتيد، عما إذا كان يمكن أيضا استخدامها في التحليل لتسمية وتحديد البروتينات التي تجمع حول زوج من البروتينات المتفاعلة لا يزال إلى إثبات. ومؤخرا جداً، استخدمت التطور الموجه لإنشاء توربويد ومينيتوربو، نوعين مختلفين من البيرا * مع تعزيز النشاط التي تسمح للإطارات الزمنية التوسيم أقصر بكثير، وصولاً إلى 10 دقيقة26. سيتم تكييف سبليت-بيويد لهذه المتغيرات الجديدة مواصلة توسيع نطاق استخدام هذا الأسلوب إلى حقل أوسع للتطبيقات.

كما تنفذ المهام الأكثر الخلوية بالبروتينات بشكل حيوي تجميع الجزيئات المجمعات، تحديد تفاعلات البروتين البروتين (PPI) مسعى رئيسيا في البحوث الطبية الحيوية. وفي الواقع، PPI غالباً ما رفع الضوابط التنظيمية في المرض وتمثل أهدافا محتملة للتداوي1. الأكثر استخداماً طريقة لتحديد مؤشر أسعار المنتجين هو نهج تنقية (AP) تقارب فيها، عقب تحلل الخلية، على وجه التحديد هو تنقية وتين فائدة في مصفوفة والبروتينات المرتبطة بها يتم تحديدها لاحقاً بواسطة الكتلي (مللي ثانية). بينما AP-مرض التصلب العصبي المتعدد نهج قوية، عادة لا أداء جيدا على مجمعات البروتين ضعيفة الذوبان، وتفاعلات عابرة جداً أو PPI التي تتطلب بنية سليمة سوبسيلولار. علاوة على ذلك، يمكن أن تكون معقدة الطابع الدينامي لشبكات PPI، تفسير البيانات بروتين وحيد هو غالباً جزء من عدة مجمعات البروتين متميزة.
تم مؤخرا تطوير تقنيات الوسم قرب مثل بيويد2 أو3،APEX24 لمعالجة بعض أوجه قصور نهج AP-مرض التصلب العصبي المتعدد. في بيويد، يحفز إنزيم البيرا * (المقابلة لمتغير G115R إنزيم كولاي نوع البرية) تشكيل مجا بيوتينيل أمبير (بيو-أمبير) التي يمكن أن تتفاعل مع الأمينات الأولية. مقابل الإنزيم نوع البرية، التي تحتفظ بالحيوية-أمبير في مركز نشط، البيرا * النشرات بيو-أمبير مما يسمح نشرها في البيئة المجاورة لها. ومن ثم، عندما تنصهر وتين اهتمام وأعرب عنها في الخلايا، يمكن أن تكون البروتينات الدانية بيوتينيلاتيد ضمن مجموعة ما يقدر 10 نانومتر5. وهذه علامة الدانية البروتينات ثم تم عزلة بواسطة streptavidin المنسدلة وتحديد من مرض التصلب العصبي المتعدد. مقابل AP-مرض التصلب العصبي المتعدد، يتطلب بيويد التعبير عن البروتين الانصهار. فإنه يمكن وبالتالي تطبق فقط على البروتينات التي لا يعوقها مهمتها وضع علامات. وعلاوة على ذلك، سرعة وضع العلامات بطيء، عادة 6 – 24 ح2،6، مما يجعل الكشف عن البروتينات لم تدم طويلاً الصعبة. حتى الآن، بالمقارنة مع وكالة اسوشييتد برس-MS، MS بيويد يوفر العديد من المزايا الرئيسية: أولاً، أن يلتقط التفاعلات في بيئتها الخلوية الأصلية؛ البروتينات الثاني، المسمى بدلاً من تجميعها في مجمعات معزولة وعقب تحلل الخلية؛ ثالثا، بولدوونس ستريبتافيدين تسمح باستخدام المخازن المؤقتة يشوه وظروف قاسية الغسيل. ومن ثم فالاسلوب أكثر حساسية للكشف عن التفاعلات التي تحدث في محدد أو عابرة أو التفاعلات الضعيفة7 ومن الصعب عزل الهيكل سوبسيلولار8.
ومع ذلك، معظم البروتينات تشكل عادة جزءا من المجمعات الكبيرة التي يمكن إعادة تشكيلها وفقا للإشارات الخلوية أو الدالة التي تحتاج إلى إجراء. ومن ثم، بروتين وحيد عادة جزءا من عدة مجمعات، المقابلة للوحدات الوظيفية المتميزة، التي تشمل متميزة و/أو تداخل PPI. كلا النهجين إعطاء لمحة عامة عن جميع الجمعيات قد يكون بروتين معين، لكنها أخفقت في معالجة سياق PPI الفردية. لزيادة دقة هذا الأخير، لقد قمنا بتصميم مقايسة تكامل شظايا بروتين (PCA) في يمكن فيه الشظايا غير نشط اثنين من البيرا * (نبيرا *، الذي يحتوي على المجال الحفاز، وكبيرى * يمكن عرضها كالمجال إعادة التنشيط) يحشدوا في إنزيم نشط عندما جلبت على مقربة من قبل اثنين تتفاعل البروتينات9. الإنزيم بيويد تقسيم الناتج يركز بيوتينيليشن قرب تعتمد على البروتينات التجمع حول زوج من البروتينات المتفاعلة، ويسمح بالتالي تحديد سياق البروتين تعتمد الجمعيات. أظهرنا سلطة القرار المعلقة من سبليت-بيويد مؤخرا بحل مجمعين البروتين المتميزة المشاركة في وساطة ميرنا إسكات الجينات المسار9.
بالإجمال، في مقايسة واحد وبسيط، يسمح سبليت-بيويد اكتشاف، وعلى وجه التحديد تعيين PPI للوحدات الوظيفية المحددة التي تشارك بروتين معين، قدمت المعروف بروتين متفاعلة إضافية من البروتين المقابل المعقدة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td>To make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution 25% NH3</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>6012</td>
			<td>To dissolve biotin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9518</td>
			<td>To select transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor plus sonification device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Other sonification devices are also ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td>To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076</td>
			<td>Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Ultra reagent</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BFU05L</td>
			<td>Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99002</td>
			<td>Any other model is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td>If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA miniprep kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2951</td>
			<td>Dox is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2948</td>
			<td>Make 1M stock solution, store at -20 &#176;C and always use fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 680-conjugated streptavidin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21848</td>
			<td>to use with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A5097</td>
			<td>Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32205</td>
			<td>Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td>To adjust pH of biotin stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763</td>
			<td>Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td>12083</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>Any other transfection reagent is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145</td>
			<td>To block Western blot membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3198</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 10% (w/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31434</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (Nonidet P40 substitute)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>To wash cells before scrapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Added to the lysis buffer to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90003</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90004</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90008</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90009</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0555S</td>
			<td>To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 4-20% SDS precast gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG42012</td>
			<td>To use when running samples for MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue LDS Sample Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB31010</td>
			<td>Running buffer for the RunBlue precast gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5030</td>
			<td>Comes as a 20% stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tet-free serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181T</td>
			<td>we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855</td>
			<td>Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127</td>
			<td>Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split-bioid &#8212; proteomic analysis of context-specific protein complexes in their native cellular environment

لتكملة القائمة انجذاب تطهير (AP) نهج لتحديد تفاعلات البروتين البروتين (PPI)، أدخلت إنزيمات تسمح العلامات المعتمدة على مقربة من البروتينات في الخلايا الحية. واحد هذه الإنزيم، البيرا * (المستخدمة في نهج بيويد)، يتوسط بيوتينيليشن البروتينات ضمن مجموعة من حوالي 10 نانومتر. ومن ثم، عندما تنصهر وتين فائدة والمعبر عنها في الخلايا، فإنه يسمح وسم البروتينات الدانية في بيئتها الأصلية. مقابل وكالة اسوشييتد برس التي تعتمد على تنقية البروتين المجتمعون المجمعات، يكشف بيويد البروتينات التي تم تمييزها داخل الخلايا بغض النظر عن ما إذا كان أنها لا تزال تتفاعل مع بروتين الفائدة عندما تكون معزولة. نظراً لأنه بيوتينيلاتيس البروتينات الدانية، واحد يمكن علاوة على ذلك الاستفادة من تقارب استثنائية من ستريبتافيدين البيوتين الغاية كفاءة عزلها. بينما بيويد أداؤها أفضل من وكالة اسوشييتد برس لتحديد عابرة أو التفاعلات الضعيفة، كلا النهجين قياس الطيف الكتلي AP-بيويد الجماعية وتقديم لمحة عامة عن جميع التفاعلات المحتملة قد يكون بروتين معين. ومع ذلك، لا توفر المعلومات في سياق كل بيكسل في البوصة المحددة. والواقع أن معظم البروتينات تعتبر عادة جزءا من عدة مجمعات، المقابلة لخطوات متميزة من النضج أو وحدات وظيفية مختلفة. لمعالجة هذا القيد المشترك لكلا الأسلوبين، أننا قد إجراء هندسة عكسية مقايسة تكامل شظايا بروتين استناداً إلى الإنزيم البيرا *. في هذا التحليل، يمكن إعادة تجميع الأجزاء الخاملة اثنين من البيرا * في إنزيم نشط عند إقامتها بالقرب من اثنين من البروتينات المتفاعلة التي تنصهر فيها. وهكذا يسمح الإنزيم بيويد تقسيم الناتج وسم البروتينات أن التجمع حول زوج من البروتينات المتفاعلة. سبليت-بيويد شريطة إلا هذين التفاعل في سياق معين، ثم يسمح تحليل وحدات وظيفية محددة تعتمد على السياق في بيئتها الخلوية الأصلية. هنا، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لاختبار وتطبيق انقسام-بيويد على زوج من البروتينات المتفاعلة.

لتوضيح كيف يعمل هذا الأسلوب، إطارات القراءة المفتوحة (Orf) من البروتينات Ago2، TNRC6C وديسير (جميع المعنيين في الجينات بوساطة ميرنا إسكات المسار) قد تم استنساخ في سبليت-بيويد والبلازميدات. ومن المعروف Ago2 للتفاعل مع TNRC6C داخل المستحثة ميرنا إسكات معقدة (ميريسك) التي تقمع الترجمة وحفز تسوس الهدف مرناس14. السابقة لتجميع ميرسك، Ago2 التفاعل مع ديسير، الإنزيم الذي ينتج ميرناس ناضجة، داخل مجمع التي قد تحصل على تحميل مع ميرنا15. ومن ثم طبقت سبليت--بيويد Ago2/ديسير الزوج أو الزوج Ago2/TNRC6C. لكل زوج من البروتينات المختبرة، كان Ago2 أما تنصهر نبيرا * أو * كبيرى استخدام لدينا والبلازميدات سبليت-بيويد (الشكل 2)، وتفتيت ديسير و TNRC6C إلى البيرا المشابهة * المقابلة. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت كل البروتين تنصهر فيها كبيرى * ويقترن نبيرا *--فيوجن التجارة والنقل كعنصر سلبي. هذه النتائج في اختبار التكرارات أربعة لكل زوج من اختبار البروتين (الجدول 1).
لاختبار ما إذا كان يتم تنشيط انقسام-بيويد على التفاعل بين زوج البروتينات المختبرة، تابعنا النظام هو مبين في الشكل 1. تم transfected البلازميدات عابر في خط متوافق هيلا خلية تيت--نظام. كان الناجمين عن التعبير عن البروتينات الانصهار مع الدوكسي (دوكس) وحفز بيوتينيليشن عن طريق إضافة البيوتين الزائدة إلى متوسط النمو. وبعد فترة حضانة ح 20 مع دوكس والبيوتين، تفكيك الخلايا وتحليلها بواسطة النشاف الغربية باستخدام streptavidin مترافق لكشف البروتينات بيوتينيلاتيد. في خلايا الثدييات، شريطين الرئيسية هي عادة الكشف عن طريق streptavidin مترافق في العينة أونترانسفيكتيد (الشكل 3نجوم) وتتوافق مع اندوجينوسلي بيوتينيلاتيد البروتينات (mitochondrial الأرجح كاربوكسيلاسيس). هذه العصابات اثنين موجودة في جميع العينات، ويمكن استخدامها كعناصر تحكم تحميل الداخلية مريح، وبالتالي، الكشف عن البروتين التدبير المنزلي للتحكم في التحميل من البروتين تساوي مبالغ زائدة عن الحاجة. نموذجية لتجربة بيويد/سبليت-بيويد، العصابات الرئيسية الإضافية التي يمكن ملاحظتها هي البروتينات الانصهار التي حصلت على بيوتينيلاتيد المتمتعة بالحكم الذاتي. حتى لو كان ينظر إلى لا بروتين بيوتينيلاتيد أخرى، كشف بيوتينيليشن البروتينات الانصهار في هذه المرحلة الفعل يشير إلى أن تتفاعل البروتينات اختبار اثنين في الخلايا. في هذه التجربة هو مبين في الشكل 3، من الواضح أن وجود نبيرا *-البروتين الانصهار Ago2 يقترن كبيرى * الأنشطار إلى TNRC6C أو ديسير أكثر كفاءة من تركيبات المعاكس في كبيرى التي *-من إقران Ago2 إلى نبيرا * اندماج اثنين آخرين البروتينات (الشكل 3، اللوحة العلوية، مقارنة الكثافة الممرات 2-3 على الممرات 6-7). وعلاوة على ذلك، تم التفعيل محددة كما يمكن تنشيط أي من اندماج كبيرى * نبيرا *-البروتين الانصهار مراقبة التجارة والنقل إلى مستويات ملموس (الشكل 3، قارن حارات 1، 4-5 للين 8 الذي يتوافق مع الخلايا أونترانسفيكتيد). منذ في أعمالنا والبلازميدات، نبيرا * علامة حركة وكبيرى * وقد علامة علم (الشكل 2)، يمكن تحليل مستويات التعبير كل البروتين الانصهار مع الأجسام المضادة ضد هذه العلامات اثنين (الشكل 3، اللوحة السفلية).
عندما يلاحظ بيوتينيليشن الناجمة عن التفاعل، ويمكن الارتقاء بالتجربة، وعزل البروتينات بيوتينيلاتيد على ستريبتافيدين-إلى جانب الخرز كما هو مبين في الفقرة 4 من البروتوكول (الشكل 4). عند القيام بالعزلة في المرة الأولى، قد حللت جميع الخطوات للتنقية الغربية النشاف (الشكل 5). بشكل عام، ينبغي أن تكون ملزمة الخرز الكمية تقريبا وتقريبا أي تسرب من خلال ينبغي أن يراعي في يغسل. قبل تجهيز العينات الكتلي، نوصي بتشغيل وصمة عار غربية لضمان بيوتينيليشن التي يسببها يعمل كما هو متوقع، وأن أعرب عن البروتينات الانصهار. عدم وجود تعبير البروتينات الانصهار أما بسبب كفاءة تعداء الفقيرة أو تحريض دوكس الخاطئ. إذا أبديت البروتينات الانصهار ولكن لوحظ لا بيوتينيليشن، تحقق من إذا البيوتين الزائدة (50 ميكرومتر) أضيفت فعلا إلى المتوسط وأن البيوتين الأسهم لا تزال نشطة. عندما يتم تحليل المواد التيد في جل الملطخة بأخذ بروتين (الشكل 6)، عادة، يعمل في كاتشين حوالي 17 الفرقة الأقوى التي يتعين مراعاتها ويناظر streptavidin أحادي. كما يمكن ملاحظة الفرق المقابلة للبروتينات بيوتينيلاتيد الذاتية والبروتينات الانصهار. ونحن عادة المكوس مجال لين عينة فوق الفرقة ستريبتافيدين تصل إلى تحميل جيدا (الشكل 6). يمكن تخزينها في أنبوب 1.5 مل الفرقة قصت وإرسالها إلى مرفق الكتلي. بدلاً من ذلك، قد يكون البروتينات منضم التربسين هضم على الخرز إلى جانب streptavidin وهضم الببتيدات التيد تشكل العمود. نستخدم بشكل روتيني البرمجيات ماكسكوانت16 (باستخدام المعلمات الافتراضية معظمها وإضافة بيوتينيليشن يسين كتعديل بوستترانسلاشونال ممكنة، انظر المرجع 9 لمزيد من التفاصيل والنتائج النموذجية MS) لتحليل البيانات الخام مرض التصلب العصبي المتعدد بيرسيوس جناح17 للتحليل الإحصائي لاحقة، وكلاهما البرمجيات الحرة. عادة ما يتم تشغيل عينات في ثلاثة replicates البيولوجية. استخدام القياس الكمي خالية من التسمية، يمكن التعرف على وجه التحديد البروتينات المخصب على مراقبة الأوضاع. لتصفية اندوجينوسلي بيوتينيلاتيد البروتينات والبروتينات غير تحديداً المسماة بإنزيم البيرا *، نحن ننظر فقط البروتينات التي هي إلى حد كبير أثري أكثر يضرب من ست مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها مع ستة من البروتينات غير ذات صلة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن ننظر فقط عدد الزيارات التي هي أثرت على dataset سبليت-بيويد فيها البروتينات الانصهار نبيرا * وقد حلت محلها نبيرا *-التجارة والنقل. وقد اقترحت استراتيجيات أخرى لتحليل بيانات خاصة باستخدام النظائر المستقرة وسم مع الأحماض الأمينية في خلية ثقافة (سيلك) للكمية البروتيوميات18. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد وصف استراتيجيات مختلفة لعزل مباشرة من الببتيدات بيوتينيلاتيد باستخدام متغير ستريبتافيدين مع تقارب ضعف إلى18من البيوتين، شروط شطف الخاصة باستخدام المذيبات العضوية19 أو البيوتين محددة الأجسام المضادة20،21. بينما ليس بالضرورة تؤدي إلى اكتشاف المزيد من البروتينات، تحديد مواقع بيوتينيليشن إضافة المزيد من الثقة فيما يتعلق بالطابع الخاص ليضرب وهي مفيدة عند معالجة الطوبولوجيا للتفاعل.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg"> رقم 1: نظرة عامة حول الإجراء سبليت-بيويد- البروتين 1 يتفاعل مع البروتين 2 كجزء من مجمع (أ)، أو مع البروتين 3 كجزء من "مجمع باء" للتحقيق على وجه التحديد تكوين A معقدة، يمكن تطبيق سبليت-بيويد للبروتينات 1 و 2. صورة مطياف كتلة تحت الإبداعي العموم إسناد حصة على حد سواء 3.0 Unported ترخيص وتم تحميلها من https://commons.wikimedia.org مع اسم الملف ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg"> رقم 2: شرائط التعبير من والبلازميدات سبليت-بيويد- ونحن نقدم والبلازميدات الأربعة للسماح باختبار كافة تركيبات من نبيرا * وكبيرى * البروتينات الانصهار. تتوفر هذه البلازميدات وخرائط كاملة في addgene.org تحت الأرقام المشار إليها. والبلازميدات عنصر تيت مراعية (7 x تيتو) وتحتاج إلى استخدامها في خلية خط متوافق مع نظام التعبير تيت. أيضا ملاحظة أن تنصهر في جميع والبلازميدات Orf فكبب و FRB إلى نبيرا * كبيرا * وشظايا على التوالي. تتفاعل هذه البروتينات اثنين فقط حضور ربمسن وبالتالي يمكن استخدامها في والبلازميدات لاختبار النظام بسرعة في وجود أو عدم وجود هذه المواد الكيميائية9. مواقع التقييد المشار إليها فريدة من نوعها. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg"> الشكل 3: وصمة عار "الغربية نموذجية" لتجربة سبليت-بيويد- اللوحة العلوية: الكشف عن البروتينات بيوتينيلاتيد مع ستريبتافيدين المسمى فلوريسسينتلي. لوحة أقل: الكشف عن البروتينات الانصهار مع الأجسام المضادة حركة والمضادة العلم. تم اختبار أزواج اثنين من البروتينات: Ago2/TNRC6C و Ago2/ديسير. في الممرات 2 و 3، تم إلحاق Ago2 إلى جزء كبيرا *. في حارات 6 و 7، تم إلحاق Ago2 إلى الجزء نبيرا *. لا توجد إشارة هامة قد لوحظ عند أي من البروتينات الثلاثة كانوا جنبا إلى جنب مع نبيرا *-التجارة والنقل (الممرات 1، 4-5). تشير النجوم إلى العصابات المقابلة للبروتينات بيوتينيلاتيد التي يمكن أن تكون بمثابة الضوابط الداخلية تحميل اندوجينوسلي. وهذا الرقم مقتبس من الشكل 5B من شوب et al. 9 تحت رخصة "الإبداعي العموم الإسناد 4.0 الدولية". <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg"> الشكل 4: نظرة عامة حول الإجراء المنسدلة ستريبتافيدين. يصور الخطوات الرئيسية لعزل البروتينات بيوتينيلاتيد لتحليل الطيف الكتلي. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg"> الرقم 5: وصمة عار "الغربية نموذجية" لتجربة المنسدلة ستريبتافيدين. يساوي حجم كل عينة المشار إليه تم تحميلها على الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide هلام. وبعد النشاف الغربية، تم اكتشاف البروتينات بيوتينيلاتيد مع ستريبتافيدين إلى جانب برنامج الصحة الإنجابية. عصابات تناظر نبيرا *-TNRC6C وكبيرى--يتم الإشارة إلى Ago2. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg"> رقم 6: جل البروتين الملطخة "أخذ نموذجي" لتحليل الطيف الكتلي. كان حملت على جل بروتين الجاهزة العينة التيد من ستريبتافيدين-إلى جانب الخرز وتشغيل حتى ترحيل العينة 2-3 سم. الفرقة الرئيسية ينظر في كاتشين حوالي 17 ستريبتافيدين. اقتطعت منطقة مباشرة أعلاه أن الفرقة وأرسل إلى مرفق الكتلي. عصابات تناظر نبيرا *-TNRC6C وكبيرى--يتم الإشارة إلى Ago2. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>نموذج تعداء</td>
			<td colspan="3">حالة اختبار</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">نبيرا *-protein1/كبيرى *--protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">كبيرى *-protein1/نبيرا *--protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">نبيرا *-التجارة والنقل/كبيرا *--protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">نبيرا *-التجارة والنقل/كبيرى *--protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">لا تعداء</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: عادة اختبار الشروط عند تطبيق انقسام-بيويد على اثنين من البروتينات.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الدليل التمهيدي للتسلسل</td>
			<td>التسلسل</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاسيت 1 عكس التمهيدي (الانصهار كبيرى *)</td>
			<td>تاتاكتتكتاجاجاتاجاك</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاسيت 2 عكس التمهيدي (الانصهار نبيرا *)</td>
			<td>جتجتتجتككااكتكاتك</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: تسلسل كبسولة تفجير والبلازميدات سبليت-بيويد.

Watch this Scientific Journal Video about Split-BioID Ã¢â‚¬â€ Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment at JoVE.com

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتقسيم-بيويد، مقايسة شظايا-تكامل بروتين استناداً إلى تقنية الوسم قرب بيويد. تنشيط على التفاعل بين اثنين من البروتينات معينة، يتيح تحليل البروتيوميات مجمعات البروتين تعتمد على السياق في بيئتها الخلوية الأصلية. الطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة ويتطلب معدات المختبرات القياسية فقط.

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...