Dette arbejde blev finansieret af det tyske Forskningsråd (DFG) gennem initiativet tysk topkvalitet (CellNetworks DFG-EXC 81) og et delvis finansiering af fælles forskningscenter SFB638.

<ol>
	<li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules,+big+targets:+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge.">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging.">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling.">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes.">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li><li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation.">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li><li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes.">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li><li>B&#233;thune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells.">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci.">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing.">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li><li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex.">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Asc1p/Receptor+for+Activated+C+Kinase+1+(RACK1)+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast.">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li><li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity.">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSITe:+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation.">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins.">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li><li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs.">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li><li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID:+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions.">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+TurboID+for+efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms.">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Den skitserede fremgangsmåde beskriver, hvordan du klone gener af interesse i split-BioID plasmider, hvordan man tester for interaktion-induceret biotinylation og hvordan du kan isolere biotinylated proteiner til massespektrometri analyse. Vi beskriver her en metode baseret på forbigående Transfektion. Mens udtryk for fusion proteiner kan indstilles af mængden af dox tilsættes til mediet, kan forbigående Transfektion føre til uensartede protein udtryk med nogle celler, der groft overexpress fusion proteiner i forhold til den endogene modparter. Dette kan føre til forvridninger af det tilsvarende interactomes og PPI, der ikke giver et retvisende billede af interaktioner, der involverer de endogene proteiner. Det er således generelt tilrådeligt at konstruere stabil cellelinjer, når split-BioID er blevet etableret med den forbigående system. Plasmider er forenelige med Flp-medierede rekombination system og placere begge gener af interesse reguleres af den samme tet-responderende element. Hvis det er nødvendigt, og når det bruges med kompatible pattedyrceller, tillader de nem oprettelsen af stabile inducerbar cellelinjer. For eksempel, bruge vi linjen HeLa-EM2-11, der udtrykker rtTA tetracyclin-aktiveret transkription aktivere og en unik markedssegment genomisk locus hvorfra tetracyklin-medieret genekspression kan være stramt reguleret12. Brug denne cellelinje og Flp-medierede rekombination, kan stabil cellelinjer, der indeholder kun én kopi af transgenet fås i to-tre uger. Alternativt kunne man også bruge nuværende genom redigering teknikker for at indføre BirA * fragmenter i de indfødte genomiske loci af gener af interesse.
Som i enhver assay, der bygger på kodning en protein, skal man overveje, hvis de resulterende fusion proteiner er funktionelle. Tilgængelige data i som proteiner af interesse blev markeret (for eksempel med normal god landbrugspraksis for billeddiagnostiske undersøgelser) og funktionelt testet er nyttige til at beslutte, hvis BirA * fragmenter bør være klonet opstrøms eller nedstrøms gener af interesse. Hvis ikke sådanne oplysninger foreligger, man bør teste N-terminalt eller C-terminalt markeret proteiner i en funktionel analyse. For eksempel, kan aktiviteten af fusion proteiner testes i en cellelinje, hvori den endogene protein har været bankede-out og forhold til vildtype. Hvis proteiner af interesse tåle både N - og C-terminale tags, skal begge testes. Faktisk, i BioID eksperimenter, orientering af fusion protein kan påvirke effektiviteten af mærkning22. Derudover har vi bemærkede, at når anvende split-BioID til et par af proteiner, hvilket af de to proteiner er føjet til enten den NBirA * eller CBirA * fragment også indflydelse effektivitet mærkning9. I split-BioID plasmider, de 16 aminosyre lang glycin/Serin rige linkers kobling proteiner af interesse at BirA * fragmenter blev taget fra en anden PCA23 og arbejdet for os i alle interagerende proteiner vi har testet indtil videre. Dog bør man overveje at nogle protein par kan fungere bedre med kortere eller længere linkers. Afsluttende note, blev en anden analyse beskrevet af Bollen gruppe24. I denne analyse, er BirA * delt på et andet websted (E140/Q141) end vores (E256/G257). Vi har testet både split-BioID varianter side-by-side og fandt, at E256/G257, beskrevet i denne protokol, fører til stærkere genaktivering når koblet til to interagerende proteiner9.
En generel ulempe ved denne metode er den langsomme hastighed af mærkning. Typisk er 6 til 24 h inkubationstiden med biotin nødvendig for at opnå mærkbare biotinylation6, udelukker brug af denne teknik til at studere dynamisk remodellering af proteinkomplekser. Mens dette assay delvist løser denne advarsel som det aktiveres kun, når to proteiner interagere, langsom hastighed mærkning udelukke dets brug for at studere svar meget dynamiske processer eller analysere kortlivede proteiner. Manipuleret peroxidase APEX2 er kendt for at fremme effektiv mærkning af proksimale proteiner inden for 1 min3. En PCA baseret på APEX2 kan således tage begrænsninger af langsomme mærkning BioID-afledte assays. En proof-of-principle undersøgelse beskrives sådan en split-APEX2 assay25. Selv om en homodimerizing protein var med held biotinylated, er om analysen kan også bruges til at mærke og identificere proteiner, der samles omkring et par af interagerende proteiner imidlertid påvises. For ganske nylig blev styret udviklingen brugt til at oprette TurboID og miniTurbo, to varianter af BirA * med øget aktivitet, der giver mulighed for meget kortere mærkning tidsvinduer, ned til 10 min26. Tilpasse split-BioID til disse nye varianter vil yderligere udvide brugen af denne teknik til et bredere felt af programmer.

Som de fleste cellulære funktioner udføres af proteiner, der dynamisk samler makromolekylære komplekser, er identificering af protein-protein interaktioner (PPI) en større bestræbelse i biomedicinsk forskning. Faktisk PPI er ofte dereguleret i sygdom og repræsenterer potentielle mål for therapeutics1. Mest udbredte metode til identifikation af PPI er affinitet rensning (AP) tilgang, hvor, efter celle lysis, et protein af interesse er specielt renset på en matrix og tilknyttede proteiner er efterfølgende identificeret ved massespektrometri (MS). Mens AP-MS er en kraftfuld tilgang, udfører det typisk ikke godt på tungtopløselige proteinkomplekser, meget forbigående interaktioner eller PPI, der kræver en intakt subcellulært struktur. Derudover kan fortolkning af data blive kompliceret af den dynamiske natur af PPI netværk, som en enkelt protein er ofte en del af flere forskellige proteinkomplekser.
Nærhed-mærkning teknikker såsom BioID2 eller APEX23,4 blev for nylig udviklet for at løse nogle af begrænsningerne af AP-MS tilgange. I BioID katalyserer enzym BirA * (svarende til en G115R variant af vildtype E. coli enzym) dannelsen af labile biotinyl-AMP (bio-AMP) som kan reagere med primære aminer. I modsætning til det enzym, vildtype, der bevarer bio-AMP i sin aktive center, frigiver BirA * bio-AMP giver sin diffusion til det omkringliggende miljø. Derfor, når smeltet til en protein af interesse og udtrykt i celler, proksimale proteiner kan være biotinylated inden for en anslået række 10 nm5. Disse markeret proksimale proteiner er derefter isoleret af streptavidin pulldown og identificeret af MS. I modsætning til AP-MS kræver BioID udtryk for en fusion protein. Det kan derfor kun anvendes på proteiner hvis funktion ikke hæmmes af tagging. Desuden hastigheden af mærkning er langsom, typisk 6 – 24 h2,6, hvilket gør opdagelse af kortvarig proteiner udfordrende. Endnu, i forhold til AP-MS, BioID-MS giver adskillige vigtige fordele: første, dens fanger interaktioner i deres native cellulære miljø; andet, mærket proteiner i stedet for samlet komplekser er isoleret efter celle lysis; for det tredje streptavidin pulldowns giver mulighed for ved hjælp af denaturering buffere og barske vask betingelser. Metoden er derfor mere følsomme til at påvise forbigående eller svage interaktioner7 eller samspil, der opstår på en bestemt og skrap hen til isolere subcellulært struktur8.
Men de fleste proteiner er normalt en del af større komplekser, som kan omskabe ifølge cellular køindikatorer eller til den funktion, der skal udføres. Derfor, en enkelt protein er typisk en del af flere komplekser, svarende til forskellige funktionelle enheder, der omfatter særskilt og/eller overlappende PPI. Begge tilgange giver et overblik over alle foreninger en given protein kan have, men de undlader at løse som led i individuelle PPI. For at øge opløsningen af sidstnævnte, har vi designet en protein-fragmenter komplementering analyse (PCA) i hvilke to inaktive fragmenter af BirA * (NBirA *, der indeholder den katalytiske domæne, og CBirA * der kan ses som re-aktivering domæne) kan Saml ind i en aktiv enzym når bragt i umiddelbar nærhed af to interagere proteiner9. Den resulterende split-BioID analysen fokuserer nærhed-afhængige biotinylation på proteiner, der samles omkring et par af interagerende proteiner og herigennem tillader identifikation af kontekst afhængige protein forsamlinger. Vi har for nylig vist fremragende opløsning magt split-BioID ved at løse to særskilte proteinkomplekser involveret i miRNA-medieret genhæmning vej9.
Helt, i et enkelt og simpelt assay, split-BioID giver mulighed for at opdage og specifikt tildeler PPI for definerede funktionelle enheder, hvor en given protein er involveret, forudsat at en supplerende interagerende protein af det tilsvarende protein kompleks er kendt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td>To make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution 25% NH3</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>6012</td>
			<td>To dissolve biotin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9518</td>
			<td>To select transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor plus sonification device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Other sonification devices are also ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td>To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076</td>
			<td>Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Ultra reagent</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BFU05L</td>
			<td>Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99002</td>
			<td>Any other model is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td>If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA miniprep kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2951</td>
			<td>Dox is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2948</td>
			<td>Make 1M stock solution, store at -20 &#176;C and always use fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 680-conjugated streptavidin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21848</td>
			<td>to use with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A5097</td>
			<td>Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32205</td>
			<td>Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td>To adjust pH of biotin stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763</td>
			<td>Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td>12083</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>Any other transfection reagent is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145</td>
			<td>To block Western blot membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3198</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 10% (w/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31434</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (Nonidet P40 substitute)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>To wash cells before scrapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Added to the lysis buffer to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90003</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90004</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90008</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90009</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0555S</td>
			<td>To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 4-20% SDS precast gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG42012</td>
			<td>To use when running samples for MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue LDS Sample Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB31010</td>
			<td>Running buffer for the RunBlue precast gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5030</td>
			<td>Comes as a 20% stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tet-free serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181T</td>
			<td>we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855</td>
			<td>Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127</td>
			<td>Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split-bioid &#8212; proteomic analysis of context-specific protein complexes in their native cellular environment

For at supplere eksisterende affinitet rensning (AP) tilgange til identifikation af protein-protein interaktioner (PPI), har indført enzymer, der giver mulighed for nærhed-afhængige mærkning af proteiner i levende celler. En sådan enzym, BirA * (bruges i BioID tilgang), medierer biotinylation af proteiner inden for en rækkevidde af ca 10 nm. Derfor, når smeltet til en protein af interesse og udtrykt i celler, det giver, mærkning af proksimale proteiner i deres oprindelige miljø. I modsætning til AP, der bygger på rensning af samlet proteinkomplekser, registrerer BioID proteiner, der er markeret i celler, uanset om de stadig interagere med protein af interesse, når de er isoleret. Da det biotinylates proksimale proteiner, man kan desuden kapitalisere på det ekstraordinære affinitet af streptavidin for biotin meget effektivt isolere dem. Mens BioID præsterer bedre end AP til at identificere forbigående eller svage interaktioner, giver begge AP og BioID masse massespektrometri tilgange et overblik over alle mulige interaktioner en given protein kan have. De giver imidlertid ikke oplysninger om som led i hver identificerede PPI. Faktisk, de fleste proteiner er typisk en del af flere komplekser, svarende til forskellige modning trin eller forskellige funktionelle enheder. For at løse denne fælles begrænsning af begge metoder, har vi udviklet en protein-fragmenter komplementering analysen baseret på BirA * enzymet. I denne analyse, kan to inaktive fragmenter af BirA * Saml til en aktiv enzym når bragt i umiddelbar nærhed af to interagerende proteiner som de er smeltet. Resulterende split-BioID analysen giver således mulighed for mærkning af proteiner, der samles omkring et par af interagerende proteiner. Såfremt disse to interagere kun i en given kontekst, split-BioID derefter giver mulighed for analyse af specifikke kontekst-afhængige funktionelle enheder i deres native cellulære miljø. Her, leverer vi en trinvis protokol for at teste og anvende split-BioID til et par af interagerende proteiner.

For at illustrere, hvordan denne metode virker, de åbne læserammer (ORFs) af proteinerne, Ago2, blev TNRC6C og Dicer (alle involveret i den miRNA-medieret genhæmning pathway) klonet i split-BioID plasmider. Ago2 er kendt for at interagere med TNRC6C inden for en miRNA-induceret silencing complex (miRISC), undertrykker oversættelse og stimulere henfald af target mRNAs14. Forudgående at samle miRISC, Ago2 interagerer med Dicer, det enzym, der producerer modne miRNAs, inden for et kompleks, hvor det kan få fyldt med en miRNA15. Dermed blev split-BioID anvendt til enten Ago2/Dicer par eller Ago2/TNRC6C par. For hvert par af testede proteiner blev Ago2 enten sammenvokset til NBirA * eller CBirA * ved hjælp af vores split-BioID plasmider (figur 2), og Dicer og TNRC6C til den tilsvarende beslægtet BirA * fragment. Derudover hvert protein var sammenvokset til CBirA * og parret med en NBirA *-normal god landbrugspraksis fusion som en negativ kontrol. Dette resulterer i at teste fire iterationer for hvert par af testede protein (tabel 1).
For at teste, om split-BioID aktiveres ved interaktion af par af testede proteiner, fulgte vi den ordning, der er afbildet på figur 1. Plasmider var forbigående transfekteret i en tet-systemet kompatibelt HeLa cellelinie. Udtryk for fusion proteiner blev induceret med doxycyclin (dox) og biotinylation var stimuleret ved at tilføje overskydende biotin til vækstmediet. Efter en 20 h inkubationstiden med dox og biotin, blev celler mængden og analyseret af Western blotting af konjugeret streptavidin til påvisning af biotinylated proteiner. I pattedyrceller, to store bands er typisk opdaget af den konjugerede streptavidin i den untransfected prøve (figur 3, stjerner) og svarer til endogent biotinylated proteiner (sandsynligvis mitokondrie carboxylases). Disse to bands er til stede i alle prøver og bekvemt kan bruges som intern lastning kontrolelementer, påvisning af en husholdning protein til at styre lastning af lig protein beløb er således overflødigt. Typisk for en BioID/split-BioID eksperiment, ekstra store bands, der kan observeres er fusion proteiner, der fik selv-biotinylated. Selvom ingen andre biotinylated protein ses, angiver opdage biotinylation af fusion proteiner på dette tidspunkt allerede, at de to testede proteiner interagerede i cellerne. Eksperimentet afbildet på figur 3, er det klart, at det at have en NBirA *-Ago2 fusion protein parret med CBirA * alternativ til TNRC6C eller Dicer er mere effektiv end de modsatte kombinationer i hvilke CBirA *-Ago2 er parret til NBirA * fusioner af to andre proteiner (figur 3, øverste panel, sammenligne intensiteten af baner 2-3 til baner 6-7). Derudover aktivering var bestemt som ingen af CBirA * fusioner kunne aktivere NBirA *-normal god landbrugspraksis kontrol fusion protein til mærkbare niveauer (figur 3, Sammenlign baner 1, 4-5 til lane 8, der svarer til untransfected celler). Da i vores plasmider, NBirA * har en myc-tag og CBirA * har et FLAG tag (figur 2), kan udtrykket niveauer hver fusion protein analyseres med antistoffer mod disse to tags (figur 3, nederste panel).
Når interaktion-induceret biotinylation er observeret, eksperimentet kan skaleres, og biotinylated proteiner isoleret på streptavidin-kombineret perler som angivet i punkt 4 i protokol (figur 4). Når du udfører isoleret første gang, kan alle trin i rensning analyseres ved Western blotting (figur 5). Typisk binding til perlerne bør være næsten kvantitative og stort set ingen lækage gennem bør overholdes i vasker. Forudgående behandling af prøver til massespektrometri, anbefaler vi kører en vestlige skamplet for at sikre induceret-biotinylation fungeret som forventet og at fusion proteiner blev udtrykt. Udtryk for fusion proteiner mangler enten på grund af dårlig Transfektion effektivitet eller defekt dox induktion. Hvis fusion proteiner blev udtrykt, men ingen biotinylation er observeret check hvis overskydende biotin (50 μM) faktisk blev tilføjet til medium og at den bestand biotin er stadig aktiv. Når det eluted materiale er analyseret på en Coomassie farvede protein gel (figur 6), typisk, den stærkeste band skal overholdes kører på ca. 17 kDa og svarer til monomere streptavidin. Bånd svarende til endogen biotinylated proteiner og fusion proteiner kan også observeres. Vi typisk punktafgifter inden for prøven lane ovenfor streptavidin bandet op til lastning godt (figur 6). Skåret bandet kan gemmes i en 1,5 mL tube og sendt til en massespektrometri facilitet. Alternativt, bundne proteiner kan også være trypsin fordøjes på de streptavidin-kombineret perler og fordøjet peptider elueret danne kolonnen. Vi rutinemæssigt bruger MaxQuant software16 (bruger det meste standardparametre og tilføje lysin biotinylation som et muligt posttranslationel modifikation, se reference 9 for flere detaljer og typiske MS resultater) at analysere de rå data, MS og de Perseus suite17 for de efterfølgende statistiske analyser, begge er gratis software. Prøverne er typisk kører i tre biologiske replikater. Bruger etiket-fri kvantificering, kan specielt beriget proteiner identificeres over kontrol betingelser. Hvis du vil filtrere for endogent biotinylated proteiner, og proteiner, der er ikke specielt mærket af BirA * enzymet, overveje vi kun proteiner, der er betydeligt beriget over hits fra seks datasæt genereret med seks uafhængige proteiner. Derudover vi kun overveje hits, der er beriget over en split-BioID datasæt, hvor NBirA * fusion proteinerne er blevet erstattet af NBirA *-normal god landbrugspraksis. Andre data analyse strategier er blevet foreslået, navnlig ved hjælp af stabile isotop mærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) for kvantitative proteomics18. Derudover er forskellige strategier blevet beskrevet for den direkte isolation af biotinylated peptider ved hjælp af en streptavidin variant med svækket affinitet til biotin18, særlige eluering betingelser ved hjælp af organiske opløsningsmidler19 eller biotin-specifikke antistoffer20,21. Mens ikke nødvendigvis fører til opdagelsen af flere proteiner, identifikation af biotinylation steder tilføje mere tillid med hensyn til den særlige karakter af hits og er nyttige når adressering topologien for en interaktion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg"> Figur 1: oversigt over proceduren split-BioID. Protein 1 interagerer med protein 2 som en del af komplekse A eller protein 3 som en del af komplekse B. Hvis du vil specifikt sonde sammensætning af komplekse A, kan split-BioID anvendes til proteiner 1 og 2. Fotografi af den massespektrometer er under en Creative Commons Attribution-Share Alike 3,0 Unported license og blev hentet fra https://commons.wikimedia.org med filnavnet på ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg"> Figur 2: udtryk kassetter af split-BioID plasmider. Vi leverer fire plasmider at teste alle kombinationer af NBirA * og CBirA * fusion proteiner. Plasmider og komplet maps er tilgængelig på addgene.org under de angivne tal. Plasmider har en tet-responderende element (7 x Millie) og skal bruges i en cellelinje, som er kompatibel med tet udtryk system. Bemærk også, at i alle plasmider ORFs af FKBP og FRB er sammenvokset til NBirA * og CBirA * fragmenter henholdsvis. Disse to proteiner interagere kun under overværelse af rapamycin og dermed plasmider kan bruges til hurtigt at teste systemet i tilstedeværelsen eller fraværet af denne kemiske9. Den angivne begrænsning steder er unikke. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg"> Fig. 3: typisk Western blot for en split-BioID eksperiment. Øverste panel: påvisning af biotinylated proteiner med fluorescently mærket streptavidin. Nederste panel: påvisning af fusion proteiner med anti-Myc og anti-FLAG antistoffer. To par af proteiner blev testet: Ago2/TNRC6C og Ago2/Dicer. I baner 2 & 3, blev Ago2 vedlagt CBirA * fragment. I baner 6 & 7, blev Ago2 vedlagt NBirA * fragment. Ingen betydelig signal blev observeret, når nogen af de tre proteiner blev kombineret med NBirA *-normal god landbrugspraksis (baner 1, 4-5). Stjernerne angiver bands svarende til endogent biotinylated proteiner, der kan tjene som interne lastning kontrolelementer. Dette tal er tilpasset fra figur 5B af Schopp et al. 9 under en Creative Commons Attribution 4.0 International licens. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg"> Figur 4: oversigt over proceduren streptavidin pulldown. Store skridt til isolering af biotinylated proteiner til massespektrometri analyse er afbildet. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg"> Figur 5: typisk Western blot for en streptavidin pulldown eksperiment. Lige mængder af hver anført prøve blev indlæst på en SDS-polyacrylamid gel. Efter Western blotting, biotinylated proteiner blev opdaget med HRP-kombineret streptavidin. Bånd svarende til NBirA *-TNRC6C og CBirA-Ago2 er angivet. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg"> Figur 6: typisk Coomassie farvede protein gel for massespektrometri analyse. Den eluted prøve fra streptavidin-kombineret perler blev læsset på en færdigstøbte protein gel og køre indtil prøven vandrer 2-3 cm. Den store band set på ca. 17 kDa er streptavidin. Området direkte over at band er skåret ud og sendes til et massespektrometri facilitet. Bånd svarende til NBirA *-TNRC6C og CBirA-Ago2 er angivet. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transfektion prøve</td>
			<td colspan="3">Betingelse testet</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-normal god landbrugspraksis / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-normal god landbrugspraksis / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">ingen Transfektion</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Testet typisk betingelser, når du anvender split-BioID på to proteiner.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sekventering primer</td>
			<td>sekvens</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kassette 1 omvendt primer (CBirA * fusion)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kassette 2 omvendt primer (NBirA * fusion)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Sekventering primere for split-BioID plasmider.

Watch this Scientific Journal Video about Split-BioID Ã¢â‚¬â€ Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment at JoVE.com

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Vi leverer en trinvis protokol for split-BioID, en protein fragmenter-komplementering analyse baseret på den nærhed-mærkning teknik BioID. Aktiveret på samspillet mellem to givne proteiner, tillader det proteomics analysen af kontekst-afhængige proteinkomplekser i deres native cellulære miljø. Metoden er enkel, omkostningseffektiv og kræver kun almindeligt laboratorieudstyr.

Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Syntese af 1,2-Azaborines og udarbejdelsen af ​​deres proteinkomplekser med T4 lysozym Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese til forbedret påvisning af protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion af menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteom-analyse af menneskers makrofag polarisering Under en lav ilt miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...