Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Onderzoeksraad (DFG) via het Duitse excellence-initiatief (CellNetworks DFG-EXC 81) en een gedeeltelijke financiering door het centrum voor onderzoek in samenwerkingsverband SFB638.

<ol>
	<li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules,+big+targets:+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge.">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging.">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling.">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes.">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li><li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation.">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li><li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes.">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li><li>B&#233;thune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells.">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci.">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing.">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li><li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex.">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Asc1p/Receptor+for+Activated+C+Kinase+1+(RACK1)+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast.">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li><li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity.">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSITe:+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation.">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins.">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li><li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs.">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li><li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID:+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions.">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+TurboID+for+efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms.">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De geschetste procedure beschrijft hoe te klonen van genen van belang in de split-BioID plasmiden, hoe om te testen voor interactie-geïnduceerde biotinylation en hoe te isoleren biotinyleerd eiwitten voor spectrometrische analyse. Hier beschrijven we een procedure op basis van voorbijgaande transfectie. Terwijl de expressie van de fusie-eiwitten kan worden afgesteld door de hoeveelheid dox toegevoegd aan het medium kan voorbijgaande transfectie leiden tot niet-homogene eiwit expressie met sommige cellen die grove overexpress het fusie-eiwitten in vergelijking met de endogene tegenhangers. Dit kan leiden tot verstoring van de bijbehorende interactomes en tot PPI die weerspiegelen niet getrouw de interacties die betrekking hebben op de endogene eiwitten. Het is dus in het algemeen aan te raden om te bouwen van stabiele cellijnen Zodra split-BioID is opgezet met het voorbijgaande systeem. De plasmiden zijn compatibel met het Flp-gemedieerde recombinatie systeem en plaats beide genen van belang onder de regulering van hetzelfde tet-responsief element. Indien nodig, en bij gebruik met compatibele zoogdiercellen, maken ze het gemakkelijk van stabiele afleidbare cellijnen. We gebruiken bijvoorbeeld de HeLa-EM2-11 lijn die spreekt uit de tetracycline-geactiveerde transcriptie activator van rtTA en een unieke targetable genomic locus waaruit tetracycline-gemedieerde genexpressie strak gereguleerde12kan worden. Met behulp van deze cellijn en Flp-gemedieerde recombinatie, kunnen stabiele cellijnen die slechts één exemplaar van de transgenic bevatten worden verkregen binnen twee of drie weken. Anderzijds kan men ook huidige genoom bewerkingstechnieken gebruiken om het BirA fragmenten in de inheemse genomic loci van de genen van belang.
Zoals in elke bepaling die afhankelijk is van een eiwit tagging, moet men overwegen als de resulterende fusie-eiwitten functioneel zijn. Beschikbare gegevens in die de proteïnen van belang waren gelabeld (bijvoorbeeld met GFP voor imaging studies) en functioneel getest zijn nuttig om te beslissen als de BirA-fragmenten moeten worden gekloond stroomopwaarts of stroomafwaarts de genen van belang. Als geen dergelijke gegevens beschikbaar zijn, moet een N-terminaal testen of C-terminaal gelabeld eiwitten in een functionele test. Bijvoorbeeld, kan de activiteit van de fusie-eiwitten worden getest in een cellijn waarin de endogene proteïne is knock-out en vergeleken met de situatie van de wild-type. Als de proteïnen van belang beide N - en C-terminal codes tolereren, moeten beide worden getest. Inderdaad, in BioID experimenten, de oriëntatie van de fusieproteïne kan beïnvloeden de efficiëntie van het labelen van22. Bovendien, hebben wij geconstateerd dat wanneer toepassing van split-BioID op een paar van eiwitten, welke van de twee eiwitten wordt toegevoegd aan hetzij de NBirA * of CBirA * fragment ook invloed de efficiëntie van het labelen van9. In de split-BioID-plasmiden, de 16 aminozuur lange glycine/serine rijke linkers koppelen van de proteïnen van belang aan de BirA-fragmenten werden overgenomen uit een ander PSO23 en werkte voor ons voor alle interacterende eiwitten we hebben getest tot nu toe. Men moet echter overwegen dat sommige paren eiwit beter zou kunnen met kortere of langere linkers werken. Van de definitieve nota, werd een ander assay beschreven door de Bollen groep24. In deze test, is BirA * verdeeld op een andere site (E140/Q141) dan de onze (E256/G257). We hebben getest zowel split-BioID smaken side-by-side en vond dat E256/G257, beschreven in dit protocol, tot sterkere Re-activering leidt wanneer gekoppeld aan twee interacterende eiwitten9.
Een algemeen nadeel van deze methode is de lage snelheid van labeling. De incubatietijd van 6 tot en met 24 h met biotine is meestal nodig zijn om merkbare biotinylation6, zich verzet tegen het gebruik van deze techniek voor de studie van dynamische remodelleren van eiwitcomplexen. Terwijl deze test gedeeltelijk adressen dit voorbehoud zoals het alleen geactiveerd wordt wanneer twee eiwitten interactie, de langzame snelheid van labeling beletsel voor het gebruik ervan voor de studie van de reactie op de zeer dynamische processen of analyseren van kortstondige eiwitten. De gemanipuleerde peroxydase APEX2 is bekend dat de bevordering van efficiënte etikettering van proximale eiwitten binnen 1 min3. Een PSO op basis van APEX2 kan dus de beperkingen van de trage labeling van BioID afkomstige tests pakken. Een bewijs-van-principe studie beschreven die een split-APEX2 assay25. Hoewel een homodimerizing eiwit met succes biotinyleerd was, blijft of de test ook gebruikt kan worden voor het label en het identificeren van eiwitten die rond een paar interacterende eiwitten verzamelen echter om te worden aangetoond. Zeer onlangs, gerichte evolutie werd gebruikt om TurboID en miniTurbo, twee varianten van het BirA met verbeterde activiteit waarmee veel korter labeling tijd windows, tot 10 min26te maken. Split-BioID naar deze nieuwe varianten aan te passen zal een verdere uitbreiding van het gebruik van deze techniek tot een breder gebied van toepassingen.

Zoals meest cellulaire functies worden uitgevoerd door eiwitten die dynamisch macromoleculaire complexen monteren, is de identificatie van eiwit-eiwitinteractie (PPI) een grote inspanning in biomedisch onderzoek. Inderdaad, PPI zijn vaak gedereguleerd in ziekte en doelwit voor therapeutiek1vertegenwoordigen. De meest gebruikte methode voor de identificatie van PPI de affiniteit zuivering (AP) aanpak waarin is, naar aanleiding van de lysis van de cel, een proteïne van belang specifiek op een matrix wordt gezuiverd en geassocieerde eiwitten worden vervolgens geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). Terwijl AP-MS een krachtige aanpak is, doet het meestal niet goed presteren op slecht oplosbare eiwitcomplexen, zeer voorbijgaande interacties of PPI die vergen een intacte subcellular structuur. Bovendien is dat de interpretatie van de gegevens kan worden bemoeilijkt door de dynamische aard van PPI netwerken, zoals een één eiwit vaak onderdeel van verscheidene verschillende eiwitcomplexen is.
Nabijheid-labeling technieken zoals BioID2 of APEX23,4 werden onlangs ontwikkeld om ingaan op enkele van de beperkingen van de AP-MS benaderingen. In BioID katalyseert het enzym BirA * (overeenkomend met een G115R variant van het wild type E. coli enzym) de vorming van onstabiele biotinyl-AMP (bio-AMP) die met primaire amines reageren kan. In tegenstelling tot het wild type enzym, dat bio-AMP in zijn actief Centrum behoudt, releases BirA * bio-AMP waardoor de verspreiding aan de naburige milieu. Vandaar, als gesmolten aan een proteïne van belang, maar uitgedrukt in cellen, proximale eiwitten kunnen biotinyleerd binnen een geschat bereik van 10 nm5. Deze gemarkeerd proximale eiwitten zijn vervolgens door daar pulldown geïsoleerd en geïdentificeerd door MS. In tegenstelling tot AP-MS vereist BioID de uitdrukking van een fusieproteïne. Het kan dus alleen worden toegepast op eiwitten waarvan de functie niet wordt belemmerd door tagging. Bovendien, de snelheid van labeling is traag, meestal 6-24 h2,6, waardoor de detectie van kortstondige eiwitten uitdagend. Toch, in vergelijking met de AP-MS, BioID-MS biedt verschillende voordelen: ten eerste, de vangt de interacties in hun inheemse cellulaire omgeving; tweede, gelabelde proteïnen in plaats van geassembleerde complexen zijn geïsoleerd na de lysis van de cel; Ten derde, daar pulldowns toestaan met behulp van denatureren buffers en harde wassen voorwaarden. Vandaar, de methode is meer gevoelig voor het detecteren van voorbijgaande aard of zwakke interacties7 of interacties die op een specifieke plaatsvinden en moeilijk te isoleren subcellular structuur8.
De meeste eiwitten zijn echter meestal deel uit van grotere complexen die remodelleren kan volgens cellulaire signalen of naar de functie die moet worden uitgevoerd. Vandaar, een één eiwit is meestal onderdeel van verschillende complexen, overeenkomt met de verschillende functionele eenheden, waarbij verschillende en/of overlappende PPI. Beide benaderingen geven een overzicht van alle verenigingen die een bepaald eiwit wellicht, maar verzuimen om aan te pakken van de context van afzonderlijke PPI. Het vergroten van de resolutie van de laatste, hebben wij een eiwit-fragmenten complementatie analyse (PCA) ontworpen in welke twee inactief fragmenten van BirA * (NBirA *, dat de katalytische domein bevat, en CBirA * die kan worden gezien als het domein van de Re-activering) kan Monteer in een actieve enzym toen bracht in de nabijheid van twee interactie eiwitten9. De resulterende split-BioID bepaling is de nabijheid-afhankelijke biotinylation gericht op eiwitten die verzamelen rond een paar interacterende eiwitten en dus maakt de identificatie van de context afhankelijke eiwitten assemblages. We toonden onlangs de uitstekende resolutie kracht van split-BioID wordt omgezet in twee afzonderlijke eiwitcomplexen die betrokken zijn bij de miRNA-gemedieerde gen-zwijgen traject9.
Over het geheel genomen in een enkele en eenvoudige assay kunt split-BioID ontdekken en PPI specifiek toe te wijzen aan gedefinieerde functionele eenheden waarin een bepaald proteïne is betrokken, voor zover dat een extra interactie eiwit van het complex bijbehorende eiwit is bekend.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td>To make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution 25% NH3</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>6012</td>
			<td>To dissolve biotin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9518</td>
			<td>To select transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor plus sonification device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Other sonification devices are also ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td>To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076</td>
			<td>Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Ultra reagent</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BFU05L</td>
			<td>Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99002</td>
			<td>Any other model is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td>If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA miniprep kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2951</td>
			<td>Dox is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2948</td>
			<td>Make 1M stock solution, store at -20 &#176;C and always use fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 680-conjugated streptavidin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21848</td>
			<td>to use with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A5097</td>
			<td>Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32205</td>
			<td>Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td>To adjust pH of biotin stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763</td>
			<td>Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td>12083</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>Any other transfection reagent is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145</td>
			<td>To block Western blot membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3198</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 10% (w/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31434</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (Nonidet P40 substitute)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>To wash cells before scrapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Added to the lysis buffer to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90003</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90004</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90008</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90009</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0555S</td>
			<td>To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 4-20% SDS precast gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG42012</td>
			<td>To use when running samples for MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue LDS Sample Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB31010</td>
			<td>Running buffer for the RunBlue precast gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5030</td>
			<td>Comes as a 20% stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tet-free serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181T</td>
			<td>we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855</td>
			<td>Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127</td>
			<td>Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split-bioid &#8212; proteomic analysis of context-specific protein complexes in their native cellular environment

Ter aanvulling van de bestaande affiniteit zuivering (AP) benaderingen voor de identificatie van eiwit-eiwitinteractie (PPI), enzymen zijn ingevoerd waarmee de nabijheid-afhankelijke labeling van proteÃ¯nen in levende cellen. Één dergelijke enzym, BirA * (gebruikt in de BioID aanpak), bemiddelt de biotinylation van eiwitten binnen een bereik van ongeveer 10 nm. Vandaar, wanneer aan een proteïne van belang gesmolten en in cellen uitgedrukt, laat het de etikettering van proximale eiwitten in hun eigen omgeving. In tegenstelling tot AP die afhankelijk van de zuivering van geassembleerde eiwitcomplexen is, detecteert BioID eiwitten die binnen cellen maakt niet uit of ze nog steeds zijn interactie met de proteïne van belang wanneer zij geïsoleerd zijn gemarkeerd. Omdat het biotinylates proximale eiwitten, een kan bovendien profiteren van de uitzonderlijke affiniteit van daar voor Biotine zeer efficiënt isoleren hen. Terwijl BioID beter dan AP voor het identificeren van voorbijgaande aard of zwakke interacties presteert, bieden beide AP - en BioID-mass spectrometry benaderingen een overzicht van alle mogelijke interacties die een bepaald proteïne kan hebben. Zij doen echter geen informatie verschaffen over de context van elke geïdentificeerde PPI. Inderdaad, de meeste eiwitten zijn meestal onderdeel van verschillende complexen, overeenkomt met verschillende rijping stappen of verschillende functionele eenheden. Om aan deze gemeenschappelijke beperking van beide methoden, hebben we een eiwit-fragmenten complementatie analyse op basis van het BirA-enzym ontworpen. In deze test, kunnen twee inactief fragmenten van BirA * Monteer in een actieve enzym toen bracht in de nabijheid van twee interacterende eiwitten waarnaar zij zijn gesmolten. De resulterende split-BioID bepaling kan dus de etikettering van eiwitten dat rond een paar interacterende eiwitten verzamelen. Mits deze twee alleen in een bepaalde context werken, laat split-BioID dan de analyse van specifieke context-afhankelijke functionele eenheden in hun inheemse cellulaire omgeving. Hier bieden we een stapsgewijze protocol om te testen en de toepassing van de split-BioID op een paar interacterende eiwitten.

Om te illustreren hoe deze methode werkt, de open lezing frames (ORFs) van de eiwitten Ago2, werden TNRC6C en Dicer (alle betrokkenen in de miRNA-gemedieerde gen silencing traject) gekloond in split-BioID plasmiden. Ago2 is bekend voor interactie met TNRC6C binnen een miRNA-geïnduceerde silencing complex (miRISC) dat vertaling onderdrukt en verval van doel mRNAs14stimuleren. Voorafgaand aan het monteren van de miRISC, de Ago2 interactie met Dicer, het enzym dat volwassen miRNAs, binnen een complex waarin het krijgen met een miRNA15 geladen kanproduceert. Vandaar was split-BioID toegepast op de Ago2/Dicer pair of het paar Ago2/TNRC6C. Voor elk paar van geteste eiwitten was Ago2 een gesmolten te NBirA * CBirA * met behulp van onze split-BioID plasmiden (Figuur 2) en Dicer en TNRC6C naar de overeenkomstige cognaat BirA * fragment. Bovendien, elke proteïne was gesmolten tot CBirA * en gecombineerd met een NBirA *-GFP kernfusie als een negatieve controle. Dit resulteert in het testen van vier iteraties voor elk paar van geteste eiwit (tabel 1).
Om te testen of split-BioID wordt geactiveerd op de interactie van het paar van geteste eiwitten, volgden we de regeling afgebeeld op Figuur 1. De plasmiden waren Transient transfected in een tet-systeem compatibel HeLa cellijn. De expressie van de fusie-eiwitten is verkregen met doxycycline (dox) en biotinylation werd gestimuleerd door de overtollige Biotine toe te voegen aan het groeimedium. Na een incubatietijd van 20u met dox en biotine, werden cellen lysed en geanalyseerd door het westelijke bevlekken met behulp van geconjugeerd streptavidine biotinyleerd eiwitten. In de cellen van zoogdieren, twee grote bands worden meestal gedetecteerd door het geconjugeerd streptavidine in het untransfected monster (Figuur 3, sterren) en corresponderen met endogeen biotinyleerd eiwitten (waarschijnlijk mitochondriale carboxylases). Deze twee bands in alle monsters aanwezig zijn en gemakkelijk kunnen worden gebruikt als interne laden besturingselementen, de detectie van een eiwit huishouding waarmee het laden van gelijke eiwit bedragen is dus overbodig. Typisch voor een BioID/split-BioID experiment, de extra grote bands die kunnen worden waargenomen zijn de fusie-eiwitten die kreeg van zelf-biotinyleerd. Zelfs als geen andere biotinyleerd eiwit wordt gezien, opsporen van biotinylation van de fusie-eiwitten in dit stadium al geeft aan dat de twee geteste eiwitten interactie in de cellen. In het experiment afgebeeld op Figuur 3, is het duidelijk dat het hebben van een NBirA *-Ago2 fusieproteïne gecombineerd met CBirA * fusies te TNRC6C of Dicer is efficiënter dan het tegenovergestelde combinaties in welke CBirA *-Ago2 is gekoppeld aan NBirA * fusies van de andere twee eiwitten (Figuur 3, bovenste paneel, vergelijk de intensiteiten van 2-3 rijstroken aan rijstroken 6-7). Bovendien was de activering specifieke als geen van de CBirA *-fusies de NBirA activeren kunnen *-GFP controle fusieproteïne tot aanzienlijke niveaus (Figuur 3, vergelijk rijstroken 1, 4-5 aan steeg 8 die overeenkomt met untransfected cellen). Omdat in onze plasmiden, NBirA * een myc tag en CBirA * een vlag label (Figuur 2 heeft), kunnen de expressie niveaus van elke fusieproteïne worden geanalyseerd met antilichamen tegen deze twee codes (Figuur 3, onderste paneel).
Als interactie-geïnduceerde biotinylation wordt waargenomen, het experiment kan worden opgeschaald en de biotinyleerd eiwitten geïsoleerd op daar-coupled kralen, zoals aangegeven in punt 4 van het protocol (Figuur 4). Als u de isolatie, de eerste keer uitvoert, kunnen alle stappen van de zuivering worden geanalyseerd door Westelijke Bevlekkende (Figuur 5). Typisch, binding met de kralen moet bijna kwantitatieve en vrijwel geen lek via moet worden nageleefd in de wast. Voorafgaande verwerking van de monsters voor massaspectrometrie, raden wij uitgevoerd een westelijke vlek zodat geïnduceerde-biotinylation werkte zoals verwacht en dat de fusie-eiwitten naar voren zijn gebracht. Het gebrek aan expressie van de fusie-eiwitten is hetzij als gevolg van slechte transfectie efficiëntie of defecte dox inductie. Als de fusie-eiwitten naar voren zijn gebracht, maar geen biotinylation is waargenomen, controleert u of overtollige Biotine (50 μM) eigenlijk aan het medium zijn toegevoegd en dat de voorraad Biotine nog steeds actief is. Wanneer het eluted materiaal wordt geanalyseerd op een Coomassie gebeitste eiwit gel (Figuur 6), meestal, de sterkste band moeten worden genomen ongeveer 17 kDa prestatiestatus en komt overeen met monomeer daar. Bands die overeenkomt met de endogene biotinyleerd eiwitten en de fusie-eiwitten kunnen ook worden waargenomen. We meestal accijnzen het gebied van de baan van de steekproef boven de band daar tot het laden goed (Figuur 6). De verwijderde band kan worden opgeslagen in een tube van 1,5 mL en verzonden naar een faciliteit van de Spectrometrie van de massa. U kunt ook kunnen afhankelijke eiwitten ook trypsine-verteerd op de streptavidine-coupled parels en de verteerd peptiden geëlueerd vormen de kolom. Regelmatig gebruiken we de MaxQuant software16 (met behulp van meestal standaardparameters en lysine biotinylation als een eventuele posttranslationele wijziging toe te voegen, zie referentie 9 voor meer details en typische MS resultaten) om de MS ruwe gegevens te analyseren en de Perseus suite17 voor de latere statistische analyse, beide zijn gratis software. Monsters worden meestal uitgevoerd in drie biologische replicatieonderzoeken. Met behulp van label-vrije kwantificering, kunnen speciaal verrijkt eiwitten over controlevoorwaarden worden geïdentificeerd. Als u wilt filteren voor endogeen biotinyleerd eiwitten en proteïnen die niet-specifiek worden aangeduid door het BirA-enzym, vinden wij alleen eiwitten die aanzienlijk over treffers van zes datasets gegenereerd met zes onafhankelijke eiwitten verrijkt zijn. Daarnaast overwegen wij alleen hits die zijn verrijkt over een dataset van de split-BioID waarin de NBirA * fusie-eiwitten zijn vervangen door NBirA *-GFP. Andere data analyse strategieën zijn voorgesteld met name met behulp van stabiele isotoop labelen met aminozuren in celkweek (SILAC) voor kwantitatieve proteomics18. Daarnaast zijn verschillende strategieën beschreven voor de directe isolatie van peptides van de biotinyleerd met behulp van een streptavidine-variant met verzwakte affiniteit met biotine18, speciale elution voorwaarden met behulp van organische oplosmiddelen19 of Biotine-specifieke antilichamen20,21. Hoewel niet noodzakelijkerwijs leidt tot de ontdekking van meer eiwitten, de identificatie van biotinylation sites toevoegen meer vertrouwen over de specificiteit van de hits en is handig wanneer het aanpakken van de topologie van een interactie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg"> Figuur 1: overzicht van de procedure van de split-BioID. Eiwitten 1 interageert met eiwit 2 als onderdeel van complexe A of met eiwit 3 als onderdeel van complexe B. Als u wilt specifiek sonde de samenstelling van complexe A, kan split-BioID worden toegepast op eiwitten 1 en 2. De foto van de massaspectrometer is onder een Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported licentie en werd gedownload van https://commons.wikimedia.org met de naam van het bestand van ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg"> Figuur 2: expressie cassettes van de split-BioID-plasmiden. Wij bieden vier plasmiden zodat testen alle combinaties van NBirA * en CBirA * fusie-eiwitten. De plasmiden en volledige kaarten zijn verkrijgbaar bij addgene.org onder de aangegeven nummers. De plasmiden hebben een tet-responsief element (7 x tetO) en moeten worden gebruikt in een cellijn die compatibel is met het tet expressie systeem. Merk ook op dat in alle plasmiden de ORFs van FKBP en FRB worden gesmolten tot de NBirA * en CBirA * respectievelijk fragmenten. Deze twee eiwitten interactie alleen in aanwezigheid van rapamycin en vandaar de plasmiden kunnen worden gebruikt om het systeem snel te testen in de aanwezigheid of afwezigheid van deze chemische9. De aangegeven beperkingsplaatsen zijn uniek. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg"> Figuur 3: typische westelijke vlek voor een experiment van de split-BioID. Bovenste deelvenster: detectie van biotinyleerd eiwitten met fluorescently geëtiketteerde daar. Lagere paneel: detectie van de fusie-eiwitten met anti-Myc en Dizzee RASCAL antilichamen. Twee paren van eiwitten zijn getest: Ago2/TNRC6C en Ago2/Dicer. In rijstroken 2 & 3, werd Ago2 toegevoegd aan het CBirA-fragment. In rijstroken 6 & 7, werd Ago2 toegevoegd aan het NBirA-fragment. Geen significante signaal werd waargenomen wanneer om het even welk van de drie eiwitten werden gecombineerd met NBirA *-GFP (banen 1, 4-5). De sterren geven de bands overeenkomt met endogeen biotinyleerd eiwitten die als interne laden besturingselementen dienen kunnen. Dit percentage is aangepast van figuur 5B van Schopp et al. 9 onder een Creative Commons Naamsvermelding 4.0 internationaal-licentie. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg"> Figuur 4: overzicht van de procedure daar pulldown. Belangrijke stappen voor de isolatie van proteïnen van de biotinyleerd voor spectrometrische analyse worden afgebeeld. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg"> Figuur 5: typische westelijke vlek voor een experiment daar pulldown. Gelijke hoeveelheden van elk aangegeven monster werden geladen op een SDS-polyacrylamide-gel. Na het westelijke bevlekken, waren biotinyleerd eiwitten met HRP-coupled daar ontdekt. Bands die overeenkomt met NBirA *-TNRC6C en CBirA-Ago2 worden aangegeven. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg"> Figuur 6: typisch Coomassie gebeitste eiwit gel massaspectrometrie p.a.. Het eluted monster van daar-coupled kralen was geladen op een geprefabriceerd eiwit-gel en uitgevoerd totdat het monster migreren 2-3 cm. De grote band gezien op ongeveer 17 kDa is daar. Het gebied direct boven die band wordt weggesneden en verstuurd naar een faciliteit van de Spectrometrie van de massa. Bands die overeenkomt met NBirA *-TNRC6C en CBirA-Ago2 worden aangegeven. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Voorbeeld van de Transfectie</td>
			<td colspan="3">Voorwaarde getest</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">geen transfectie</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Getest meestal voorwaarden bij de toepassing van de split-BioID aan twee eiwitten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sequencing primer</td>
			<td>volgorde</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cassette 1 omgekeerde primer (CBirA * fusie)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cassette 2 omgekeerde primer (NBirA * fusie)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Sequencing inleidingen voor de split-BioID-plasmiden.

Watch this Scientific Journal Video about Split-BioID Ã¢â‚¬â€ Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment at JoVE.com

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Wij bieden een stapsgewijze protocol voor split-BioID, een eiwit fragmenten-complementatie test gebaseerd op de nabijheid-labeling techniek BioID. Geactiveerd op de interactie tussen twee bepaalde eiwitten, hierdoor de proteomics analyse van context-afhankelijke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving. De methode is eenvoudig, kosteneffectief en vereist alleen gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden.

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Synthese van 1,2-Azaborines en de voorbereiding van hun eiwitcomplexen met T4 lysozym Mutanten

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissectie van menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...