Dette arbeidet ble finansiert av tysk forskningsråd (DFG) gjennom tyske excellence initiativ (CellNetworks DFG-EXC 81) og en delvis finansiering av forskningssamarbeid centre SFB638.

Merk: En oversikt over metoden vises i figur 1.
1. planlegging av kloning strategi
<ol><li>Velg to åpenbart samspill proteiner som skal testes. Merk: Hver av de to proteinene ville være sammensluttet til en split-BioID fragment: NBirA * eller CBirA *. Som en negativ kontroll, CBirA * fusion proteiner testes med NBirA * del grønne fluorescerende protein (NBirA *-GFP). Som en ekstra kontroll, kan NBirA * fusjoner testes alene, uten beslektet CBirA * fusion eller i kombinasjon med en CBirA * smeltet en urelaterte protein. Det anbefales ikke å bruke CBirA *-GFP som en negativ kontroll som det ble vist konsekvent føre til store bakgrunn kombinert til noen NBirA * fusion protein9. Årsaken til denne observasjonen kan være uttrykk nivået på CBirA *-GFP, mye høyere enn noen andre CBirA * fusion proteiner vi har brukt så langt, som kan føre til betydelig reassociation med NBirA * fragmentet.</li>
	<li>
Når to proteiner er valgt, sjekke litteratur for å finne om begge har allerede er merket i funksjonelle studier (for eksempel som en GFP-merket fusion protein).
	<ol>
<li>Hvis slike studier eksisterer, Merk plasseringen av koden (på N - eller C-terminus) og bruker samme retning merke proteiner av interesse med split-BioID fragmenter.</li>
		<li>Hvis det ikke finnes noen slike studier, plan konstruksjoner koding for begge proteiner merket på N - og C-terminus og planlegge en analysen for å teste funksjonaliteten til fusion proteiner (for eksempel en redning eksperiment i cellen linje utarmet for WT protein). Merk: Når du kobler to fusion proteiner med plasmider beskrevet i figur 2 som kode lenge fleksibel linkers, retningen på fusion proteiner (BirA * fragmenter smeltet oppstrøms eller nedstrøms proteiner av interesse) vanligvis spiller ingen rolle . Faktisk bruker FRB og FKBP som modell proteiner, ble det vist at alle fire mulige gjentakelser (begge fragmenter til N-termini, både på C-jernbanestasjonen termini, på N-terminus og en C-terminus, og vice versa) gir sammenlignbare biotinylation9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Design primere å forsterke ORFs av to proteiner av interesse for kloning i split-BioID plasmider. Vær oppmerksom at oversettelsen rammene er det samme som BirA * fragmenter. Bruk begrensning enzymer PmeI og PacI for å konstruere CBirA * fusion, og enzymer ClaI og MluI for NBirA * fusion hvis bruker plasmider beskrevet i figur 2. Merk: Plasmider avbildet i figur 2 bære et toveis tet svarer element flankert av F3/FRT rekombinasjon nettsteder. Dette gjør regulert co uttrykket på omtrent samme nivå av begge fusion proteiner fra samme plasmider10og muligheten til å raskt lage stabil linjer av rekombinasjon-mediert kassett exchange (RMCE). I disse plasmider har NBirA * en myc kode mens CBirA * har en flagg-kode. ORFs kan selvfølgelig også klones på individuelle plasmider med grunnleggende arrangører. Viktige trinn: Når du tester to samspill proteiner, anbefales det å sammenligne NBirA * smeltet protein 1 kombinert med CBirA * smeltet protein 2 og NBirA * smeltet protein 2 kombinert med CBirA * smeltet protein 1. Faktisk er det ofte observert at en gjentakelse fungerer bedre enn den andre.</li>
</ol>2. kloning ORFs av genene rundt i Split-BioID plasmider
Merk: I dette eksemplet to proteiner som kan være merket på N-terminus vurdert. Fire betingelsene er testet og sammenlignet med ikke-transfekterte celler (tabell 1).
<ol><li>Bruk polymerasekjedereaksjons (PCR) for å forsterke ORFs av de to proteinene skal testes med riktig primer. Utforme primere som introdusere ClaI og MluI begrensning nettstedene for NBirA * fusion proteiner og webområdene PacI og PmeI for CBirA * fusion proteiner. Merk: PCR kan utføres med kommersielle, fortrinnsvis korrektur, DNA polymerase. Følger standard protokoll fra håndboken og tilpasse det Smeltetemperaturen primerne og lengden på ORF mikrofonfunksjon i henhold til produsenten retningslinjer.</li>
	<li>
Subclone den første ORF
	<ol>
<li>Fordøye både plasmider (ca 2 μg) og PCR-forsterket ORF1 (å være smeltet sammen til NBirA *) med ClaI og MluI. Utføre fordøyelsen reaksjoner med 1 μL av hver enzym, blandet med riktige volumet av DNA og reaksjon buffer i et totalvolum på 20 μL i en 1,5 mL tube 1t på 37 ° C.</li>
		<li>Kjøre både fordøyelsen eksempler på en 1% agarose-TAE DNA gel. Avgiftsdirektoratet bandene tilsvarer fordøyd plasmider og ORF1 med ren skalpell og overføring til 1,5 mL rør.</li>
		<li>Rense begge bandene bruker en standard DNA utvinning kit.</li>
		<li>Ligate fordøyd plasmider og ORF1 bruker standard reagenser.<ol>
<li>Ved hjelp av hemorroider kit som er angitt i Tabellen av materialer, ligate 100 ng av DNA som inneholder tre til fem tiden molar overflødig settes inn over plasmider i et totalt volum på 4,5 μL. Legge til 5 μL 2 x T4 ligase buffer og 0,5 μL T4 DNA ligase fra ligation kit. Utføre ligation reaksjonen i en 1,5 mL tube for 10 min ved romtemperatur (RT).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forvandle standard DH-5α E. coli kompetent celler (utarbeidet etter Inoues metode11).<ol>
<li>Mix 3 μL ligation reaksjonen med 50 μL av kompetente celler i en 1,5 mL tube på is og Inkuber for 30 min. overføring cellene til en varme blokkere satt til 42 ° C i 30-45 s og deretter ruge tilbake på is 2 min. legge 250 μL forvarmes (37 ° C) lysogeny kjøttkraft (LB) medium og plate 100 μL cellene i en forvarmes (37 ° C) ampicillin inneholder LB-agar plate. Inkuber cellene overnatting på 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>På den neste dagen, ta fire til seks kolonier og ruge dem ved 37 ° C, 180 rpm, overnatting i 3 mL LB medium som inneholder 100 μg⋅mL-1 ampicillin i en 15 mL tube.</li>
		<li>Isolere plasmider fra plukket koloniene bruker en standard DNA MiniPrep kit.</li>
		<li>Verifisere riktigheten av plasmider av Sanger sekvensering bruker kassett 2 omvendt primer (tabell 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Når en plasmider som inneholder den første ORF har blitt identifisert, subclone den andre ORF i at plasmider følge de samme trinnene som skritt 2.2, men ved hjelp av PmeI og PacI enzymer.</li>
	<li>Sekvens resulterende plasmider bruker kassett 1 omvendt primer (tabell 2).</li>
</ol>3. testing av Fusion proteiner
Merk: Instruksjonene nedenfor gjelder for dobbelt induserbart uttrykk plasmider (figur 2) og jakten-11ht celler, en subclonal HeLa-CCL2 celle linje, stabilt uttrykke omvendt, tetracycline-kontrollerte transkripsjon aktivator rtTA-M2 og som inneholder en locus for RMCE12. Vekstmediet for disse cellene er Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) som inneholder 10% tetracycline-fri fosterets bovin serum (FBS). Når du bruker en annen celle type, må eksakte seeding forholdene og vekstmediet tilpasses.
<ol><li>
Forbigående transfection
	<ol>
<li>Frø celler i en konsentrasjon av 1 x 105 celler i 2 mL per brønn av en seks-vel plate dagen før transfection og ruge cellene overnatting på 37 ° C, 5% CO2 i en celle kultur inkubator.</li>
		<li>Ved transfection, fjerne medium for hver brønn og erstatte med 2 mL frisk medium.</li>
		<li>Forberede fire transfection reaksjonene etter tabell 1. For hver brønn til transfect, legge til 6 µg av polyethylenimine 3 µg av plasmider DNA i en 1,5 mL steril rør og fyll til 500 µL med DMEM medium uten serum.</li>
		<li>Inkuber hver transfection blanding i minst 5 minutter ved romtemperatur før du legger til slipp klok i hver brønn. Inkuber cellene overnatting på 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induksjon og nærhet-merking
	<ol>
<li>Dagen etter transfection, fjerne mediet og erstatte med medium med biotin på 50 µM å stimulere biotinylation og doxycycline 200 ng⋅mL−1 til induserer uttrykk for fusion proteiner. Inkuber celler for minst 20 h på 37 ° C, 5% CO2.<ol>
<li>For å gjøre en lagerløsning til biotin, oppløse biotin på 50 mg⋅mL-1 (tilsvarer ca. 200 mM) i 2 M ammonium hydroksid. Når det er fullstendig oppløst, fortynne den 50 mm i 500 mM Hepes, pH 7.4, og justere pH 7,4 med HCl. Aliquot og lagre de resulterende 1000 x lagerløsning på 20 ° C. Oppløse doxycycline på 10 mg⋅mL-1 i 70% etanol og oppbevar i en skrukork microtube på 20 ° C i mørket.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Celle lysate forberedelse
	<ol>
<li>Vask cellene gang med 1 mL kaldt (4 ° C) fosfat-bufret saltvann (PBS).</li>
		<li>I hver brønn, legge 100 µL av lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT og proteasehemmere).</li>
		<li>Høste celler med cellen scrapper og overføring til 1,5 mL rør.</li>
		<li>Sentrifuge prøvene 14.000 x g i 10 min på 4 ° C fjerne celle rusk.</li>
		<li>Overføre til supernatants til frisk rør og plasser på isen.</li>
		<li>Bestemme protein beløp med en Bradford analysen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SDS-polyakrylamid gel gelelektroforese (side) og vestlige blotting
	<ol>
<li>Forberede en SDS-polyakrylamid gel.</li>
		<li>For hver fjernet lysate, forberede en side prøve 30 µg (minimum 15 µg) protein i totalt 30 µL SDS lasting bufferen. Deretter laster like mye hvert utvalg (20 µL/vel) på SDS-polyakrylamid gel og videre til geleelektroforese.</li>
		<li>Etter geleelektroforese, overføre fraksjonert proteiner til en lav fluorescens PVDF blot membran med alle standard-protokoll. Merk: For å analysere protein biotinylation, overføre en 10 min overføringstid med programmet "høy MW" av en rask semi tørr Western blotting enheten vanligvis fungerer bra.</li>
		<li>Etter overføringen, hindre membranen i 5% tørr melk i PBS i 30 min på RT.</li>
		<li>Inkuber membranen for 30-60 min på RT med fluorescerende streptavidin konjugat utvannet 1:15,000 i PBS som inneholder 2% BSA og 0,1% Tween-20.</li>
		<li>Vask membranen tre ganger, hver for 10 min, med PBS med 0,1% Tween-20, og så en gang mer med PBS.</li>
		<li>Skanne membranen på et fluorescens skanner tenkelig system. Merk: en typisk Western blot vises i Figur 3. Det over fremgangsmåten beskriver en fluorescerende-basert oppdagelsen, men en luminescence-basert oppdagelsen bruke HRP-kombinert streptavidin fungerer like godt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Split-BioID for Proteomikk studier
Kritiske Merk: For den endelige masse spectrometric analysen, alle følgende trinn er utført i keratin-gratis forhold, bør alt materiale og reagenser være som keratin-fri som mulig.
<ol><li>Forbigående transfection
	<ol>
<li>Dagen før transfection, frø tre til fire 10 cm plater for hvert vilkår i en konsentrasjon av 8 x 105 celler i 10 mL per plate, og ruge cellene overnatting på 37 ° C, 5% CO2 i en celle kultur inkubator.</li>
		<li>På den neste dagen, forberede en master transfection blanding hver transfection betingelse: for tre plater per betingelse, 36 µg av polyethylenimine og 18 µg av plasmider DNA oppløst i 900 µL serum-free DMEM. Inkuber hver master blanding i minst 5 min på RT.</li>
		<li>I mellomtiden, Erstatt medium for hver rett med fersk medium, og deretter legger 300 µL av transfection blandinger drop klokt å hver plate.</li>
		<li>Inkuber cellene overnatting på 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Induksjon og nærhet-merking
	<ol>
<li>Dagen etter transfection, overføre cellene til 15 cm retter. For hver rett, fjerne mediet, vaske cellene med 7 mL av PBS, legge til 1,5 mL av en trypsin-EDTA løsning og ruge i 5 min på RT. legge 3.5 mL av vekst medium resuspend cellene og overføre celle suspensjon til en 15 cm fat fylte med 20 mL oppblomstringen medium supplert med biotin på 50 µM å stimulere biotinylation og doxycycline på 200 ng⋅mL−1 (siste konsentrasjoner) til induserer uttrykk for fusion proteiner.</li>
		<li>Inkuber celler for minst 20 h på 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Fangst og lagring av cellene
	<ol>
<li>Vask cellene to ganger med PBS, deretter legge til 1,5 mL PBS hver plate og høste celler med en scrapper.</li>
		<li>Overføre høstet cellene tilsvarer én betingelse slik 15 mL og høste dem med sentrifugering på 1200 x g, 5 min, 4 ° C.</li>
		<li>Fjerne supernatants og fest fryse pellets i flytende nitrogen, så butikken på 80 ° C før videre behandling. Merk: Alternativt celler kan også demontert av trypsinization, høstet i vekst medium, overført til en 15 mL tube og vasket tre tid med PBS før frysing.</li>
	</ol></li>
	<li>Utarbeidelse av cellen lysates
	<ol>
<li>Resuspend celle pellets i 1 mL av lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 0,4% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 x komplett protease hemmer) på RT. Pass cellene 10-20 ganger (fem til ti slag) gjennom en 25 G nål.</li>
		<li>Sonicate prøvene med en sonification enhet. Merk: Sonification-enhet som er angitt i Tabellen for materiale, følgende program kan brukes: fire sykluser med høy intensitet, 30 s per syklus i en kald (4 ° C) vannbad. Andre sonification enheter passer men kanskje må justeres tilsvarende.</li>
		<li>Legge til Triton X-100 til den gjenopprettede sonicated lysate å nå en siste konsentrasjon på 2% (vanligvis Tilsett 100 μL av 20% Triton X-100 til 900 μL sonicated celle lysate), og deretter 2.3 mL 50 mM Tris, pH = 7.4 per 1 mL av lysate å justere NaCl konsentrasjonen til 150 mM før b inding til streptavidin-kombinert perler. Kritiske Merk: Høyere saltkonsentrasjoner fører ofte mye mindre effektiv binding til perler.</li>
		<li>Distribuere den justerte lysates i 1,5 mL rør (ca. 1,1 mL i tre rør) og sentrifuge dem på 16.000 x g, 10 min, 4 ° C.</li>
		<li>Overføring av supernatants (ca. 3.2 mL) til 15 mL tube, og holde 50-100 μL som INPUT materiale.</li>
		<li>Måle konsentrasjonen av hvert utvalg med en Bradford analysen og bruke tilsvarende 3 til 3.5 mg proteininnhold for streptavidin rullegardinmenyen.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin pulldown Merk: En oversikt over pulldown prosedyren vises i Figur 4. Det er nesten identisk med den originale protokollen publisert av Roux og kolleger2. Første gang rullegardinmenyen utføres, prøver av flyten gjennom og vask 1 – 4 kan bli satt til side for Western blot analyse å sikre prosedyren arbeidet riktig (figur 5).<ol>
<li>For hver tilstand, overføre 200 μL av streptavidin-kombinert magnetiske perler suspensjon slik 1,5 mL. Rør på en magnetisk rack, vente til perlene stikke på siden av rør (ca. 1 min) og fjerne lagringsplass bufferen.</li>
		<li>Vask perler ved å blande forsiktig med 1 mL av balanse buffer (50 mM Tris pH 7-4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100 og 1 mM DTT).</li>
		<li>Sende equilibrated perlene i samme beløp i nødvendig antall rør (vanligvis når starter med 3-3,5 mg protein innhold, lysates fra hver betingelse kan bli sendt to til fire 1,5 mL rør) og sted på magnetiske stativet.</li>
		<li>Fjern balanse bufferen og resuspend hvert sett av perler med like mye den tilsvarende cellen lysates fra trinn 4.4.7. Ruge over natten ved 4 ° C på et roterende hjul.</li>
		<li>På den neste dagen, Legg 1,5 mL rør på en magnetisk rack, vent til perlene stikke på siden av rør og overføre supernatants til en 15 mL tube merket som flyter gjennom. Merk: nå alle trinnene utføres ved romtemperatur medmindre annet er opplyst.</li>
		<li>Resuspend perler i hvert rør med 200 μL av vaskebuffer 1 (2% SDS i vann), og kombinerer hvert sett med resuspended perler tilsvarer ett vilkår i 1,5 mL rør.</li>
		<li>Vask perlene to ganger i 8 min på en rotasjon hjul med 1 mL av vaskebuffer 1.</li>
		<li>Vaske perlene to ganger i 8 min på en rotasjon hjul med 1 mL av vaskebuffer 2 (50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100 og 0,1% Na-deoxycholate).</li>
		<li>Vaske perlene to ganger i 8 min på en rotasjon hjul med 1 mL av vaskebuffer 3 (10 mM Tris pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40 og 0,5% Na-deoxycholate).</li>
		<li>Vaske perlene to ganger i 8 min på en rotasjon hjul med 1 mL av vaskebuffer 4 (50 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl, 0,1% NP-40).</li>
		<li>Sikre vaskebuffer fjernes fullstendig etter siste vask trinn, fjerne det meste av nedbryting, og deretter spinne ned prøvene. Sette tilbake på magnetiske stativet, vent til perlene stikke på siden av rør og fjern resterende bufferen.</li>
		<li>Legge til 30 μL elueringsbufferen (10 mM Tris pH 7.4, 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol og 2 mM Biotin) til perlene. Ruge på 98 ° C i 15 minutter, deretter umiddelbart fjerne perler på en magnetisk rack.</li>
		<li>Overføre eluted prøven til en frisk rør og butikk på 20 ° C før videre behandling.</li>
	</ol></li>
	<li>SDS side og vestlige blotting Merk: Før massespektrometri analyse, det anbefales å vurdere suksessen av biotinylation og pulldown SDS side og Western blot. Hvis ingen biotinylation mønster er observert en kan vurdere som enten dox eller biotin ble ikke lagt til mediet eller at en av de to lager løsningene er kompromittert.<ol>
<li>For hver input prøve, forberede en side prøve ved å blande like mye protein prøven med den riktige mengden 3 x SDS lasting buffer i tilsammen 28 μL. Forberede siden eksempler ved å blande 5 µL av hver elueringsrør prøve med 2,5 µL 3 x SDS lasting bufferen.</li>
		<li>Last prøvene (25 µL/godt for innganger, 7 µL/godt for elueringsrør prøver) på en SDS-polyakrylamid gel. Videre til gelelektroforese og Western blotting som beskrevet i del 3.4.</li>
		<li>Hvis utfører rullegardinmenyen for første gang, forberede siden eksempler for hvert trinn i rullegardinmenyen (inngang, strømme gjennom, vask 1 – 4: elueringsrør) ved å blande 20 µL av hvert utvalg (inngang, strømme gjennom, vask 1 – 4) med 10 µL av 3 x SDS lasting buffer eller 5 µL (elueringsrør) med 2,5 µL av 3 x S DS-lasting buffer og fortsetter som i trinn 4.6.4 (figur 5).</li>
	</ol></li>
	<li>SDS side for MS analyse Merk: For å redusere potensielle keratin forurensning, precast gels og kommersielle eksempel lasting buffer kan brukes.<ol>
<li>Tilsett 6,25 μL av 4 x prøve buffer 18.75 μL av hver elueringsrør prøve og kjøre prøver på en 4-20% precast SDS-gel til de migrerer 2-3 cm i gel.</li>
		<li>Stain gel med kolloidalt Coomassie briljant blå G250 flekker13 i en 15 cm Petriskål.</li>
		<li>Bruk en ren skalpell avgiftsdirektoratet hele banene for hver prøve, unntatt streptavidin bandet (som kjører på ca. 17 kDa, figur 6), og overføre forbrukeravgift bandene til 1,5 mL rør.</li>
		<li>Sende disse prøvene til et Proteomikk for videre analyse. Merk: Typisk MS resultatene kan sees i referanse 9 (Figur 3 og figur 7og supplerende tabeller). Hele datasett er tilgjengelig på stolthet depotet (tiltredelse nummer PXD005005).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules,+big+targets:+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge.">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging.">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling.">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes.">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li><li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation.">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li><li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes.">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li><li>B&#233;thune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells.">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci.">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing.">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li><li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex.">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Asc1p/Receptor+for+Activated+C+Kinase+1+(RACK1)+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast.">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li><li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity.">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSITe:+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation.">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins.">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li><li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs.">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li><li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID:+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions.">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+TurboID+for+efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms.">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Disponerte fremgangsmåten beskriver hvordan klone gener av interesse i split-BioID plasmider, hvordan å teste for samhandling-indusert biotinylation og isolere biotinylated proteiner for massespektrometri analyse. Her beskriver vi en prosedyre basert på forbigående transfection. Mens uttrykket av fusion proteiner stilles av mengden dox lagt til mediet, kan forbigående transfection føre til ikke-homogen protein uttrykk med noen celler som grovt overexpress fusion proteiner i forhold til den endogene kolleger. Dette kan føre til forvrengninger av det tilsvarende interactomes og PPT, som ikke reflekterer trofast interaksjoner som involverer endogene proteiner. Dermed er det vanligvis lurt å konstruere stabil cellelinjer når split-BioID er etablert med forbigående systemet. Plasmider er kompatible med Flp-mediert rekombinasjon systemet og plassere begge gener rundt under regulering av samme tet svarer element. Hvis nødvendig, og når den brukes med kompatibel pattedyrceller, tillater de enkel oppretting av stabil induserbart linjer. For eksempel bruker vi jakten-EM2-11 linjen som uttrykker rtTA tetracycline-aktivert transkripsjon aktivatoren og et unikt targetable genomisk locus som tetracycline-mediert genuttrykk kan være strengt regulert12. Bruker denne cellen linje og Flp-mediert rekombinasjon, kan stabil linjer som inneholder bare én kopi av transgene fås i to-tre uker. Alternativt kan en også bruke gjeldende genomet redigering teknikker for å innføre BirA * fragmenter i de opprinnelige genomisk loci av genene rundt.
Som noen analysen som merking et protein, må man vurdere hvis de resulterende fusion proteinene er funksjonelle. Tilgjengelige data som proteiner av interesse ble merket (for eksempel med GFP for imaging studier) og funksjonelt testet er nyttige å avgjøre hvis BirA * fragmenter skal klones oppstrømshastighet eller nedstrøms gener av interesse. Hvis ingen slike data er tilgjengelig, en bør teste N-Terminal eller C-terminalt merket proteiner i en funksjonell analysen. For eksempel kan aktiviteten til fusion proteinene testes i en celle linje som endogene protein er slo ut og sammenlignet med vill type situasjonen. Hvis proteiner rundt tolerere begge N - og C-terminalen koder, bør begge testes. Faktisk BioID eksperimenter, kan retningen på fusion protein påvirke effektiviteten av merking22. Dessuten, har vi observert at når bruke split-BioID til et par av proteiner, hvilken av de to proteinene legges til enten i NBirA * eller CBirA * fragment også innflytelse effektiviteten av merking9. I delt-BioID plasmider, den 16 aminosyre lang glysin/serine rik linkers kopling proteiner rundt BirA * fragmenter ble tatt fra en annen PCA23 og arbeidet for oss i alle samspill proteiner vi har testet så langt. Imidlertid bør man vurdere at noen protein par kan fungere bedre med kortere eller lengre linkers. Av siste notat, ble en annen analysen beskrevet av Bollen gruppe24. I denne analysen deles BirA * på et annet nettsted (E140/Q141) enn vår (E256/G257). Vi har testet begge split-BioID smaker av siden og fant at E256/G257, beskrevet i denne protokollen, fører til sterkere re-Activation kombinert to samspill proteiner9.
En generell ulempen med denne metoden er treg hastighet på merking. 6 til 24 h inkubasjon tid med biotin er vanligvis nødvendig for å oppnå betydelige biotinylation6, slik at bruk av denne teknikken for å studere dynamisk ombygging av protein komplekser. Mens denne analysen delvis løser denne påminnelse som aktiveres bare når to proteiner samhandler, treg hastighet på merking utelukke bruken for å studere svar til svært dynamisk prosesser eller analysere kortvarig proteiner. Den utviklet peroxidase APEX2 er kjent for å fremme effektiv merking av proksimale proteiner i 1 min3. En PCA basert på APEX2 kan dermed adresse begrensningene for treg merking hastighet på BioID-avledet analyser. En bevis-av-prinsippet studie beskrevet slik en split-APEX2 analysen25. Men selv om en homodimerizing protein var vellykket biotinylated, gjenstår om analysen kan også brukes til å merke og identifisere proteiner som sammen rundt et samspill proteiner å bli demonstrert. Nylig, regissert utviklingen ble brukt til å opprette TurboID og miniTurbo, to varianter av BirA * forbedret aktivitet at mye kortere merking tidsvinduer, ned til 10 min26. Tilpasse split-BioID til disse nye varianter vil ytterligere utvidet bruk av denne teknikken til et bredere felt av programmer.

Som mest cellular funksjonene utføres ved proteiner som dynamisk samle macromolecular komplekser, er identifikasjon av protein-protein interaksjoner (PPT) en stor oppgave i biomedisinsk forskning. Faktisk er ofte deregulert sykdom og representerer potensielle mål for therapeutics1. Mest brukte metoden for identifikasjon av PPT er affinitet rensing (AP) tilnærming som cellen lysis, et protein av interesse er spesielt renset på en matrise og tilhørende proteiner identifiseres senere massespektrometri (MS). AP-MS er en effektiv tilnærming, utføre det vanligvis ikke godt på dårlig løselig protein komplekser, veldig forbigående interaksjoner eller PPI som krever en intakt subcellular struktur. Videre kan tolkningen av dataene være komplisert av dynamikken i PPI nettverk, som en enkelt protein er ofte en del av flere forskjellige protein komplekser.
Nærhet-merking teknikker som BioID2 eller APEX23,4 ble nylig utviklet for å løse noen av begrensningene av AP-MS tilnærminger. I BioID gir enzymet BirA * (tilsvarende en G115R variant av vill type E. coli enzym) dannelsen av labilt biotinyl-AMP (bio-AMP) som kan reagere med primære aminer. I motsetning til vill type enzymet, som beholder bio-AMP aktive midt, utgivelser BirA * bio-AMP slik at dens diffusjon til nærliggende miljøet. Derfor når smeltet til et protein av interesse og uttrykt i celler, kan proksimale proteiner være biotinylated i en anslått rekkevidde på 10 nm5. Disse merket proksimale proteiner deretter isolert av streptavidin pulldown og identifisert av MS. I motsetning til AP-MS krever BioID uttrykk for en fusjon protein. Det kan derfor bare brukes proteiner som funksjon ikke er hemmet av merking. Dessuten hastigheten på merking er treg, vanligvis 6-24 h2,6, gjør påvisning av kortvarige proteiner utfordrende. Likevel, i forhold til AP-MS, BioID-MS tilbyr flere viktige fordeler: første, sin fanger samhandlinger i deres opprinnelige mobilnettet miljø; andre, merket proteiner i stedet for sammensatte komplekser er isolert etter celle lysis; tredje tillate streptavidin pulldowns denaturing buffere og harde vask forhold. Derfor er metoden mer følsom å oppdage forbigående eller svak interaksjoner7 eller samhandlinger som oppstår på en bestemt og vanskelig å isolere subcellular struktur8.
Men er de fleste proteiner vanligvis en del av større komplekser som kan renovere ifølge cellular signaler eller funksjonen som må utføres. Derfor er et enkelt protein vanligvis en del av flere komplekser, tilsvarer ulike funksjonelle enheter, som involverer forskjellige og/eller overlappende PPI. Begge metodene gir en oversikt over alle foreninger har et bestemt protein, men de ikke sammenheng med personlige PPI. Hvis du vil øke oppløsningen for sistnevnte, har vi utviklet en protein-fragmenter complementation analysen (PCA) som to inaktive fragmenter av BirA * (NBirA *, som inneholder katalytisk domenet, og CBirA * som kan vises som re-aktivisering domenet) kan reassemble i en aktiv enzym når brakt i nærheten av to samspill proteiner9. Resulterende split-BioID analysen fokuserer nærhet-avhengige biotinylation på proteiner som samle rundt et par samspill proteiner og dermed tillater identifikasjon av sammenheng avhengige protein samlinger. Vi nylig vist fremragende oppløsning makt split-BioID ved å løse to distinkt proteinet komplekser involvert i miRNA-mediert gen-stanse veien9.
Sammen i en enkelt, enkel analysen kan split-BioID oppdage og spesielt tilordne PPT til definerte funksjonsenhetene som et bestemt protein er involvert, gitt en mer samhandlende protein av tilsvarende proteinet er kjent.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td>To make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution 25% NH3</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>6012</td>
			<td>To dissolve biotin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9518</td>
			<td>To select transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor plus sonification device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Other sonification devices are also ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td>To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076</td>
			<td>Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Ultra reagent</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BFU05L</td>
			<td>Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99002</td>
			<td>Any other model is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td>If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA miniprep kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2951</td>
			<td>Dox is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2948</td>
			<td>Make 1M stock solution, store at -20 &#176;C and always use fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 680-conjugated streptavidin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21848</td>
			<td>to use with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A5097</td>
			<td>Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32205</td>
			<td>Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td>To adjust pH of biotin stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763</td>
			<td>Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td>12083</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>Any other transfection reagent is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145</td>
			<td>To block Western blot membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3198</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 10% (w/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31434</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (Nonidet P40 substitute)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>To wash cells before scrapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Added to the lysis buffer to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90003</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90004</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90008</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90009</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0555S</td>
			<td>To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 4-20% SDS precast gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG42012</td>
			<td>To use when running samples for MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue LDS Sample Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB31010</td>
			<td>Running buffer for the RunBlue precast gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5030</td>
			<td>Comes as a 20% stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tet-free serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181T</td>
			<td>we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855</td>
			<td>Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127</td>
			<td>Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split-bioid &#8212; proteomic analysis of context-specific protein complexes in their native cellular environment

For å utfylle eksisterende affinitet rensing (AP) tilnærminger til å identifisere protein-protein interaksjoner (PPT), enzymer har innført at nærhet-avhengige merkingen av proteiner i levende celler. En slik enzym, BirA * (brukt i BioID tilnærming), formidler biotinylation proteiner innenfor en rekkevidde på ca 10 nm. Derfor når smeltet til et protein av interesse og uttrykt i celler, kan merkingen av proksimale proteiner i sitt eget miljø. I motsetning til AP som rensing av sammensatte protein komplekser, oppdager BioID proteiner som er merket i celler uansett om de fortsatt samhandler med protein av interesse når de er isolert. Siden det biotinylates proksimale proteiner, kan en videre kapitalisere på det eksepsjonelle affinitet til streptavidin for biotin svært effektivt isolere dem. Mens BioID utfører bedre enn AP identifiserende forbigående eller svak interaksjoner, gir begge AP - og BioID-masse massespektrometri tilnærminger en oversikt over alle mulig interaksjoner et bestemt protein kan ha. Men gir de ikke informasjon i forbindelse med hver identifisert PPI. Faktisk er de fleste proteiner vanligvis en del av flere komplekser, svarer til forskjellige modning trinn eller ulike funksjonelle enheter. For å løse denne felles begrensning av begge metodene, har vi utviklet en protein-fragmenter complementation analysen basert på BirA * enzymet. I denne analysen, kan to inaktive fragmenter av BirA * montere i en aktiv enzym når brakt i nærheten av to samspill proteiner som de er smeltet. Resulterende split-BioID analysen kan dermed merkingen av proteiner som sammen rundt et samspill proteiner. Gitt disse to bare samhandle i en gitt kontekst, tillater split-BioID deretter analyse av bestemt sammenheng-avhengige funksjonelle enheter i sitt opprinnelige mobilnettet miljø. Her gir vi en trinnvis protokoll for å teste og bruke split-BioID til et par samspill proteiner.

For å illustrere hvordan denne metoden fungerer, åpent lesing rammene (ORFs) av proteiner Ago2, ble TNRC6C og Dicer (alle involverte i miRNA-mediert genet stanse sti) klonet i split-BioID plasmider. Ago2 er kjent for å bruke TNRC6C fra et miRNA-indusert stanse kompleks (miRISC) som represses oversettelse og stimulere forfallet av målet mRNAs14. Før å montere miRISC, Ago2 samhandle med Dicer, enzymet som produserer modne miRNAs, i et kompleks som det kan bli lastet med en miRNA15. Dermed ble split-BioID brukt til Ago2/Dicer paret eller Ago2/TNRC6C paret. For hvert par av testet proteiner var Ago2 enten smeltet NBirA * eller CBirA * bruker våre split-BioID plasmider (figur 2), og Dicer og TNRC6C til den tilsvarende beslektet BirA * fragment. I tillegg hver protein var smeltet til CBirA * og sammen med en NBirA *-GFP fusion som en negativ kontroll. Dette resulterer i testing fire gjentakelser for hvert par testet protein (tabell 1).
For å teste om split-BioID aktiveres på samspillet av to testet proteiner, fulgte vi ordningen avbildet i figur 1. Plasmider var transiently transfekterte i tet-systemet kompatibelt HeLa cellen linje. Uttrykket av fusion proteiner ble indusert med doxycycline (dox) og biotinylation ble stimulert ved å legge til overmål biotin vekstmediet. Etter en 20 h inkubasjon tid med dox og biotin, celler lysed og analyseres av vestlige blotting bruker konjugert streptavidin å oppdage biotinylated proteiner. I pattedyrceller, to store band oppdages vanligvis av konjugert streptavidin i untransfected utvalget (Figur 3stjerner) og tilsvarer biotinylated proteiner (sannsynligvis mitokondrie carboxylases) endogenously. Disse to band finnes i alle prøvene og kan enkelt brukes som interne lasting kontroller, dermed deteksjon av en husholdning protein kontrollere lasting av lik protein er overflødig. Typisk for en BioID/split-BioID eksperiment, ekstra store bandene som kan observeres er fusion proteiner som fikk selv-biotinylated. Selv om ingen andre biotinylated protein er sett, angir oppdage biotinylation fusion proteiner på dette stadiet allerede at to testet proteiner interaksjon i cellene. I forsøket avbildet på Figur 3, det er klart at det å ha en NBirA *-Ago2 fusion protein forbundet med CBirA * fusjoner TNRC6C eller Dicer er mer effektiv enn de motsatte kombinasjonene i som CBirA *-Ago2 er koblet til NBirA * kombinasjoner av to andre proteiner (Figur 3, øvre panel, sammenligne intensiteter av kjørefelt 2-3 til stier 6-7). Videre aktivisering var bestemt som ingen av CBirA * fusjoner kan aktivere NBirA *-GFP kontroll fusion protein nevneverdig nivåer (Figur 3Sammenlign baner 1, 4-5 til lane 8 som tilsvarer untransfected celler). Siden i vår plasmider, NBirA * har en myc kode og CBirA * har en flagg kode (figur 2), kan uttrykket nivåene av hver fusion protein analyseres med antistoffer mot disse to kodene (Figur 3nedre panelet).
Når samhandling-indusert biotinylation er observert, eksperimentet kan skaleres og biotinylated proteiner isolert på streptavidin-kombinert perler som angitt i punkt 4 i protokollen (Figur 4). Når du utfører isolasjon første gang, kan alle trinnene i rensing analyseres av vestlige blotting (figur 5). Vanligvis binding til perlene skal nesten kvantitative og nesten ingen lekkasje gjennom observeres i lenge. Tidligere behandling prøvene for massespektrometri, anbefaler vi kjører en Western blot indusert-biotinylation fungerte som forventet og at fusion proteiner ble uttrykt. Mangel på uttrykk for fusion proteiner er enten på grunn av dårlig transfection effektivitet eller feil dox induksjon. Hvis fusion proteiner ble uttrykt, men ingen biotinylation er observert, sjekk hvis overflødig biotin (50 μM) var faktisk lagt til medium og at det lager biotin er fortsatt aktiv. Når eluted materialet er analysert på en Coomassie-farget protein gel (figur 6), vanligvis, sterkeste bandet å bli observert går på om 17 kDa og tilsvarer monomerisk streptavidin. Band tilsvarer endogene biotinylated proteiner og fusion proteinene kan også sees. Vi vanligvis avgiftsdirektoratet området eksempel kjørefelt over streptavidin bandet til lasting godt (figur 6). Forbrukeravgift bandet kan lagres i en 1,5 mL tube og sendes til et massespektrometri. Alternativt, bundet proteiner kan også være trypsin-fordøyd på streptavidin-kombinert perler og fordøyd peptidene elut danne kolonnen. Vi rutinemessig bruk MaxQuant programvare16 (bruker hovedsakelig standardparametere og legge lysin biotinylation som en mulig post-translasjonell modifikasjon, se referanse 9 for mer detaljer og for typiske MS resultater) til å analysere MS rådata og Perseus suite17 for påfølgende statistisk analyse, begge er fri programvare. Eksempler er vanligvis kjøre i tre biologiske gjentak. Bruke etikett-fri kvantifisering, kan spesielt beriket proteiner identifiseres over kontrollen forhold. Hvis du vil filtrere endogenously biotinylated proteiner og proteiner nonspecifically merket av BirA * enzymet, betenke vi bare proteiner som er betydelig beriket over treff fra seks datasett generert med seks urelaterte proteiner. Dessuten, vi bare betenke treff som er beriket over split-BioID dataset som NBirA * fusion proteiner er erstattet med NBirA *-GFP. Andre data analysen strategier foreslått spesielt med stabil isotop merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC) for kvantitative Proteomikk18. I tillegg har ulike strategier blitt beskrevet for direkte isolering av biotinylated peptider bruker en streptavidin variant med svekket affinitet til biotin18, spesielle elueringsrør betingelser ved hjelp av organiske løsemidler19 eller biotin-spesifikke antistoffer20,21. Mens ikke nødvendigvis fører til oppdagelsen av mer proteiner, identifisering av biotinylation nettsteder legger mer tillit på spesifisitet av treff og er nyttig når adressering topologien for en samhandling.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg"> Figur 1: oversikt over split-BioID prosedyren. Protein 1 samhandler med protein 2 som en del av komplekse eller protein 3 som en del av komplekse B. Å spesielt undersøke sammensetningen av komplekse A, kan split-BioID brukes på proteiner 1 og 2. Fotografiet av masse spectrometer er under en Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported lisens og ble lastet ned fra https://commons.wikimedia.org med navnet på ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg"> Figur 2: uttrykk kassetter av split-BioID plasmider. Vi tilbyr fire plasmider å tillate tester alle kombinasjoner av NBirA og CBirA * fusion proteiner. Plasmider og fullstendig kart er tilgjengelig på addgene.org under de angitte tallene. Plasmider har et tet svarer element (7 x Tejo) og må brukes i cellen linje som er kompatibel med tet uttrykk systemet. Merk også at i alle plasmider ORFs av FKBP og FRB er smeltet til NBirA * og CBirA * fragmenter henholdsvis. Disse to proteinene samhandle kun gjennom rapamycin og dermed plasmider kan brukes raskt teste systemet i tilstedeværelse eller fravær av denne kjemiske9. Webområdene angitt begrensning er unike. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg"> Figur 3: typisk Western blot for en split-BioID eksperiment. Øvre panel: gjenkjenning av biotinylated proteiner med fluorescently merket streptavidin. Nedre panel: påvisning av fusion proteiner med anti-Myc og anti-FLAGGET antistoffer. To par proteiner ble testet: Ago2/TNRC6C og Ago2/Dicer. I baner 2 & 3, ble Ago2 lagt til CBirA * fragment. I baner 6 og 7, ble Ago2 lagt til NBirA * fragment. Ingen betydelig signal ble observert når noen av tre proteiner ble kombinert med NBirA *-GFP (baner 1, 4-5). Stjernene angir bandene tilsvarer endogenously biotinylated proteiner som kan tjene som interne lasting kontroller. Dette tallet er tilpasset fra figur 5B i Schopp et al. 9 under en Creative Commons Attribution 4.0 International lisens. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg"> Figur 4: oversikt over streptavidin pulldown prosedyren. Hovedtrinn for isolering av biotinylated proteiner for massespektrometri analyse er avbildet. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg"> Figur 5: typisk Western blot for en streptavidin pulldown eksperiment. Lik av hver angitte prøve ble lastet på en SDS-polyakrylamid gel. Etter vestlige blotting, biotinylated proteiner ble oppdaget med HRP-kombinert streptavidin. Band tilsvarer NBirA *-TNRC6C og CBirA *-Ago2 angis. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg"> Figur 6: typisk Coomassie-farget protein gel for massespektrometri analyse. Eluted prøven fra streptavidin-kombinert perler ble lastet på en precast protein gel og kjøre til prøven overføre 2-3 cm. Det store bandet sett på om 17 kDa er streptavidin. Området direkte over det bandet er forbrukeravgift og sendt til et massespektrometri. Band tilsvarer NBirA *-TNRC6C og CBirA *-Ago2 angis. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hva eksempel</td>
			<td colspan="3">Tilstand testet</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">ingen transfection</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Testet vanligvis forhold når split-BioID to proteiner.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sekvensering primer</td>
			<td>sekvens</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kassett 1 omvendt primer (CBirA * fusion)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kassett 2 omvendt primer (NBirA * fusion)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Sekvensering primere for split-BioID plasmider.

Watch this Scientific Journal Video about Split-BioID Ã¢â‚¬â€ Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment at JoVE.com

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Vi gir en trinnvis protokoll for split-BioID, en protein fragmenter-complementation analysen basert på nærhet-merking teknikken BioID. Aktivert på samspillet av to gitt proteiner, kan Proteomikk analyse av sammenhengen-avhengige proteiner komplekser i sitt opprinnelige mobilnettet miljø. Metoden er enkel, kostnadseffektiv og krever bare standard laboratorieutstyr.

Split-BioID-Proteomic analyse av kontekstavhengige Protein komplekser i sitt opprinnelige mobilnettet miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifisering av lite molekyl bindende proteiner i en Native Cellular Miljø via Live-celle Photoaffinity Merking

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Syntese av 1,2-Azaborines og utarbeidelse av deres protein komplekser med T4 Lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese for forbedret deteksjon av protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Disseksjon av Human netthinnen og RPE-akkord for Proteomic analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomic analyse av menneskelig Macrophage polarisering Under et lavt oksygeninnhold miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...