Эта работа финансировалась инициативе немецкого мастерства (CellNetworks DFG-EXC 81) и частичное финансирование совместного исследовательского центра SFB638, немецкого исследовательского совета (DFG).

<ol>
	<li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules,+big+targets:+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge.">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging.">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling.">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes.">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li><li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation.">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li><li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes.">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li><li>B&#233;thune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells.">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci.">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing.">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li><li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex.">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Asc1p/Receptor+for+Activated+C+Kinase+1+(RACK1)+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast.">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li><li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity.">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSITe:+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation.">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins.">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li><li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs.">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li><li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID:+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions.">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+TurboID+for+efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms.">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Изложил процедура описывает способ клонирования генов интерес в Сплит BioID плазмид, как для тестирования взаимодействия индуцированной biotinylation и как изолировать биотинилированным белков для анализа масс-спектрометрии. Мы опишем здесь процедура, основанная на переходных transfection. В то время как выражение синтез белков могут быть настроены на величину dox, добавлен в средство, переходных transfection может привести к не однородных белков с некоторых клеток, которые грубо overexpress синтез белков по сравнению с эндогенного партнерами. Это может привести к искажениям соответствующего interactomes и PPI, не точно отражают взаимодействий, которые включают эндогенного белков. Таким образом обычно рекомендуется для построения стабильных клеточных линий после Сплит BioID был создан с временной системы. Плазмиды совместимы с системой ФЛП опосредованной рекомбинации и место оба генов интерес под регулирование тет отзывчивым и тот же элемент. Если необходимо и при использовании с совместимыми mammalian клеток, они позволяют легко создавать стабильные индуцибельной клеточных линий. Например мы используем линии HeLa-ЭМ2-11, которая выражает активатор транскрипции тетрациклин активированный rtTA и уникальный ориентации геномной локус, из которого тетрациклин опосредованной ген выражение может быть жестко регулируемых12. С помощью этой линии клеток и Flp опосредованной рекомбинации, стабильных клеточных линий, которые содержат только одну копию трансген можно получить в течение двух-трех недель. Кроме того также можно использовать текущих методов редактирования генома представить Бира * фрагменты в родной геномной локусов генов интерес.
Как и любой assay который полагается на пометки белок необходимо рассмотреть, если результирующая протеины сплавливания функциональных. Имеющихся данных, в которой были помечены протеинов интереса (например, с GFP для изображений исследования) и функционально тестирование полезно решить, если фрагменты Бира * должно быть клонированы вверх или вниз по течению гены интереса. Если такие данные не доступны, один следует проверить N-неизлечимо или C-неизлечимо tagged белков в функционального анализа. Например может испытываться активности синтеза белков в ячейки строки в котором эндогенного белка был постучал из и по сравнению с дикого типа ситуации. Если протеинов интереса терпеть как N - и C-терминала теги, оба должны быть проверены. Действительно в BioID эксперименты, ориентация синтез белка может повлиять на эффективность маркировки22. Кроме того мы наблюдали что при применении Сплит BioID пара белков, какой из двух белков добавляется либо NBirA * или CBirA * фрагмент также на влияние эффективности маркировки9. В Сплит BioID плазмид 16 аминокислот длиной глицин/сериновые богатые линкеры муфты протеинов интереса к Бира * фрагменты были взяты из другого PCA23 и работал для нас для всех взаимодействующих белки мы протестировали так далеко. Однако следует учитывать, что некоторые пары белков может работать лучше с линкеры короче или длиннее. На Последнее замечание другой пробирного был описан Боллен группы24. В этот assay Бира * делится на другом сайте (E140/Q141) чем ours (E256/G257). Мы проверили Оба Сплит BioID вкусов бок о бок и обнаружил, что E256/G257, указанных в настоящем Протоколе, приводит к сильной повторной активации при сочетании двух взаимодействующих белки9.
Один общий недостаток этого метода является низкая скорость маркировки. Как правило время инкубации 6-24 ч с биотина необходима для получения ощутимого biotinylation6, исключающих использование этой технологии для изучения динамических ремоделирования белковых комплексов. Хотя этот assay частично решает этот нюанс, как он активируется только при взаимодействии двух белков, медленная скорость маркировки исключает его использования для изучения ответ весьма динамических процессов или для анализа недолго белков. Инженерных пероксидазы APEX2 известно для содействия эффективной маркировки проксимальной белков в течение 1 мин3. PCA, основанные на APEX2 таким образом можно было бы рассмотреть ограничения маркировки скорости BioID производные анализов. Исследование доказательств принцип описал такой25Сплит APEX2 анализа. Однако хотя homodimerizing белок успешно биотинилированным, ли assay может также использоваться для обозначения и определения белков, которые собирают вокруг пары взаимодействующих белков остается быть продемонстрирована. Совсем недавно направленной эволюции был использован для создания TurboID и miniTurbo, два варианта Бира * с расширенной деятельности которые позволяют намного короче меток времени windows, вплоть до 10 мин26. Сплит BioID для этих новых вариантов адаптации будет расширить использование этого метода для широкой области применения.

Как наиболее клеточной функции выполняются белки, которые динамически собрать макромолекулярных комплексов, идентификации белок белковых взаимодействий (PPI) стремится основных в биомедицинских исследований. Действительно PPI часто дерегулирование в болезни и представляют собой потенциальные цели для терапии1. Наиболее широко используемый метод для идентификации PPI является сродства очищения (AP) подход, при котором, после лизиса клеток, протеин интереса специально очищенная на матрицу и связанные протеины впоследствии идентифицируются по масс-спектрометрии (МС). В то время как AP-МС представляет собой мощный подход, он обычно не хорошо работать на слаборастворимых белковых комплексов, очень переходных взаимодействия или PPI, которые требуют нетронутыми субцеллюлярные структуры. Кроме того интерпретация данных может быть осложнено динамичный характер сетей PPI, как один белок часто является частью нескольких различных белковых комплексов.
Близость маркировки методы, такие как BioID2 или3,APEX24 недавно были разработаны для решения некоторых ограничений AP-MS подходов. В BioID фермент Бира * (соответствующий к G115R варианту фермента дикого типа E. coli ) катализирует образование лабильной biotinyl-AMP (био AMP) которые могут реагировать с первичных аминов. В отличие от дикого типа фермента, который сохраняет био AMP в его активным центром, бира * выпускает био AMP, позволяя ее распространения его соседние среды. Следовательно когда сливается с протеином интереса и выразил в клетках, проксимальной белков может быть биотинилированным в пределах диапазона примерно 10 Нм5. Эти отмеченные проксимальной белки затем изолируются пулдаун стрептавидина и выявленные МС. В отличие от AP-MS BioID требуется выражение синтез белка. Он может таким образом применяться только к протеинам, чьи функции не препятствует пометки. Кроме того, скорость маркировки медленно, обычно 6 – 24 h2,6, делая сложным обнаружение короткоживущих белков. Тем не менее, по сравнению с AP-MS, BioID-MS предлагает несколько ключевых преимуществ: во-первых, его захватывает взаимодействия в их родной клеточной среды; Во-вторых, обозначенные протеины, вместо того, чтобы собранные комплексы изолированы после лизиса клеток; в-третьих стрептавидина pulldowns позволяют использовать денатурируя буферов и суровых Стиральная условий. Следовательно метод является более чувствительным, чтобы обнаружить переходных или слабого взаимодействия7 или взаимодействия, которые происходят на конкретную и трудно изолировать субцеллюлярные структуры8.
Однако большинство белки обычно являются частью более крупных комплексов, которые можно реконструировать зависимости клеточных сигналов или функции, которую необходимо выполнить. Следовательно один белок обычно является частью нескольких комплексов, соответствующих отдельных функциональных подразделений, с участием различных и/или перекрывающихся PPI. Оба подхода дать обзор всех ассоциаций, у данного белка, но они не выступить контексте отдельных PPI. Чтобы увеличить разрешение последнего, мы разработали фрагменты белка дополнения анализа (СПС) в которой две неактивные фрагменты Бира * (NBirA *, содержащий каталитического домена, и CBirA *, который можно рассматривать как повторной активации домена) могут собрать в активный фермент когда принес в непосредственной близости от двух взаимодействующих белки9. Близость зависимой biotinylation итоговый Пробирная Сплит BioID посвящен белки, которые собрать вокруг пары взаимодействующих белков и таким образом позволяет определить контекст зависимых белков сборок. Недавно мы продемонстрировали выдающиеся разрешающая способность Сплит BioID путем урегулирования двух различных белковых комплексов, участвующих в путь Мирна опосредованного подавления экспрессии гена9.
В общей сложности в единый и простой assay, Сплит BioID позволяет открывать и специально назначать определенные функциональные единицы, в которых данный белок является участие, при условии, что дополнительный протеин соответствующего белка комплекс известен PPI.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td>To make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution 25% NH3</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>6012</td>
			<td>To dissolve biotin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9518</td>
			<td>To select transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor plus sonification device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Other sonification devices are also ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td>To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076</td>
			<td>Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Ultra reagent</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BFU05L</td>
			<td>Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99002</td>
			<td>Any other model is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td>If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA miniprep kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2951</td>
			<td>Dox is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2948</td>
			<td>Make 1M stock solution, store at -20 &#176;C and always use fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 680-conjugated streptavidin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21848</td>
			<td>to use with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A5097</td>
			<td>Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32205</td>
			<td>Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td>To adjust pH of biotin stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763</td>
			<td>Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td>12083</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>Any other transfection reagent is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145</td>
			<td>To block Western blot membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3198</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 10% (w/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31434</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (Nonidet P40 substitute)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>To wash cells before scrapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Added to the lysis buffer to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90003</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90004</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90008</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90009</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0555S</td>
			<td>To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 4-20% SDS precast gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG42012</td>
			<td>To use when running samples for MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue LDS Sample Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB31010</td>
			<td>Running buffer for the RunBlue precast gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5030</td>
			<td>Comes as a 20% stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tet-free serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181T</td>
			<td>we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855</td>
			<td>Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127</td>
			<td>Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split-bioid &#8212; proteomic analysis of context-specific protein complexes in their native cellular environment

В дополнение к существующим очищение сродства (AP) подходит для идентификации белок белковых взаимодействий (PPI), введены ферменты, которые позволяют маркировки близости зависимых белков в живых клетках. Один из таких фермента, бира * (используется в BioID подход), опосредует biotinylation белков в диапазоне приблизительно 10 Нм. Следовательно когда сливается с протеином интереса и выразил в клетках, он позволяет маркировки проксимальной белков в их родной среде. В отличие от AP, которая опирается на очищение собрал белковых комплексов BioID обнаруживает белки, которые были отмечены в пределах ячейки независимо от того, ли они по-прежнему взаимодействовать с протеина интереса когда они изолированы. Поскольку это biotinylates проксимального белков, Кроме того можно капитализировать исключительных схожести стрептавидина биотина очень эффективно изолировать их. Хотя BioID выполняет лучше, чем AP для выявления временных или слабого взаимодействия, оба AP - и BioID масс спектрометрии подходы обеспечивают обзор всех возможных взаимодействий, у данного белка. Однако они не представить информацию о контексте каждого выявленных PPI. Действительно большинство белков, обычно являются частью нескольких комплексов, соответствующий собственный созревания шаги или различных функциональных подразделений. Для решения этой общей ограничения обоих методов, мы инженерии пробирного комплементарности фрагменты белков, основанный на фермент бира *. В этот assay два неактивных фрагменты Бира * можно собрать в активный фермент когда принес в непосредственной близости от двух взаимодействующих белков, к которым они сплавлены. Таким образом, итоговый Пробирная Сплит BioID позволяет маркировки белков, которые собирают вокруг пары взаимодействующих белков. Условии, что эти два взаимодействовать только в заданном контексте, Сплит BioID затем позволяет анализ конкретных контекстно зависимом функциональных подразделений в их родной среде сотовой. Здесь мы предоставляем пошаговые протокол для тестирования и применять Сплит BioID к паре взаимодействующих белков.

Watch this Scientific Journal Video about Split-BioID Ã¢â‚¬â€ Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment at JoVE.com

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Мы предоставляем пошаговые протокол для Сплит BioID, фрагменты дополнения assay протеина, основанный на близость маркировка технику BioID. Активирован на взаимодействии двух данного белков, он позволяет протеомики анализ контекстно зависимые белковых комплексов в их родной среде сотовой. Метод простой, экономически эффективных и только требует стандартного лабораторного оборудования.

Сплит BioID — Протеомного анализа контекстно зависимых белковых комплексов в их родной среде сотовой

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Синтез 1,2-Azaborines и подготовке их белковых комплексов с Т4 лизоцима Мутанты

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Диссекции человека сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Протеомного анализа человека макрофагов поляризации в среде с низким содержанием кислорода

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...