Detta arbete finansierades av det tyska forskningrådet (DFG) genom tyska excellence-initiativet (CellNetworks DFG-EXC 81) och en delfinansiering av collaborative research centre SFB638.

<ol>
	<li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules,+big+targets:+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge.">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging.">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling.">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes.">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li><li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation.">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li><li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes.">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li><li>B&#233;thune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells.">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci.">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing.">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li><li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex.">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Asc1p/Receptor+for+Activated+C+Kinase+1+(RACK1)+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast.">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li><li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity.">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSITe:+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation.">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins.">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li><li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs.">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li><li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID:+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions.">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+TurboID+for+efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms.">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Konturerad beskrivs hur man klona gener av intresse i den split-BioID plasmider, hur man testar för interaktion-inducerad biotinylation och hur man isolera biotinylerade proteiner för masspektrometri analys. Här beskriver vi ett förfarande baserat på övergående transfection. Medan uttrycket av fusionsproteinerna kan stämmas av mängden dox tillsätts mediet, kan övergående transfection leda till icke-homogen proteinuttryck med vissa celler som grovt överuttrycka fusionsproteinerna jämfört med den endogena motsvarigheter. Detta kan leda till snedvridning av de motsvarande interactomes och PPI som inte återspeglar troget de interaktioner som involverar de endogena proteinerna. Det är således allmänt tillrådligt att bygga stabila cellinjer split-BioID har fastställts med övergående systemet. Plasmidsna är kompatibla med systemet Flp-medierad rekombination och placera båda gener av intresse under reglering av samma tet-responsive element. Om det behövs, och när den används med kompatibel däggdjursceller, tillåter de lätt skapandet av stabila inducerbara cellinjer. Exempelvis använder vi HeLa-EM2-11 raden som uttrycker den rtTA tetracyklin-aktiverad transkription aktivatorn och en unik targetable genomisk locus som tetracyklin-medierad genuttryck kan vara hårt reglerad12. Använda denna cellinje och Flp-medierad rekombination, kan stabil cellinjer som innehåller bara en kopia av transgenens erhållas inom två-tre veckor. Alternativt kan man också använda aktuella genomet redigering tekniker för att införa BirA * fragment i de infödda genomisk loci av generna av intresse.
Som i någon analysmetod som bygger på tagga ett protein, måste man överväga om de resulterande fusionsproteinerna är funktionella. Tillgängliga data som proteinerna av intresse (till exempel med GFP för imaging studier) var etiketten och funktionellt testade är användbara att avgöra om fragment BirA * ska vara klonade uppströms eller nedströms generna av intresse. Om inga sådana uppgifter finns tillgängliga, man bör testa N-terminalt eller C-obotligt taggade proteiner i en funktionell analys. Aktiviteten av fusionsproteinerna kan till exempel testas i en cellinje som det kroppsegna proteinet har knackade ut och jämfört med vildtyp situationen. Om proteinerna av intresse tål både N - och C-terminal taggar, bör båda testas. Faktiskt i BioID experiment, kan orienteringen av proteinet fusion påverka effektiviteten i märkning22. Dessutom har vi observerat att när tillämpa split-BioID till ett par av proteiner, vilket av de två proteinerna läggs till antingen den NBirA * eller CBirA * fragmenterar också påverkan av märkning9effektivitet. I split-BioID plasmidsna, den 16 aminosyror lång glycin/serin rika linkers koppling proteinerna av intresse till BirA * fragmenten togs från en annan PCA23 och arbetat för oss i alla samverkande proteiner har vi testat hittills. Man bör dock överväga att några protein par skulle fungera bättre med kortare eller längre linkers. Av sista anmärkning beskrevs en annan analys av den Bollen grupp24. I denna analys, är BirA * uppdelad på en annan plats (E140/Q141) än vår (E256/G257). Vi har testat både split-BioID smaker sida-vid-sida och fann att E256/G257, beskrivs i detta protokoll, leder till starkare re-aktiveringen när kopplat till två samverkande proteiner9.
En allmän nackdel med denna metod är långsam hastighet märkning. 6 till 24 h inkubationstiden med biotin är vanligtvis krävs för att erhålla märkbar biotinylation6, utgör hinder för användningen av denna teknik för att studera dynamiska omdaning av proteinkomplex. Medan denna analys adresser delvis denna varning eftersom det aktiveras endast när två proteiner interagerar, långsam hastighet märkning hinder för dess användning för att studera svar mycket dynamiska processer eller analysera kortlivade proteiner. Bakåtkompilerade peroxidaset APEX2 är kända för att främja effektiv märkning av proximala proteiner inom 1 min3. En PCA baserat på APEX2 kan således ta itu begränsningarna av långsam märkning hastighet av BioID-derived analyser. En proof-of-principle studie beskrivs sådan en split-APEX2 assay25. Även om ett homodimerizing protein var framgångsrikt biotinylerade, återstår huruvida analysen kan också användas för att märka och identifiera proteiner som samlas kring ett par av samverkande proteiner emellertid påvisas. Helt nyligen användes riktad evolution för att skapa TurboID och miniTurbo, två varianter av BirA * med ökad aktivitet som tillåter mycket kortare märkning tidsfönster, ner till 10 min26. Anpassa split-BioID till dessa nya varianter kommer att ytterligare utöka användningen av denna teknik till ett bredare fält av applikationer.

Som mest cellulära funktioner utförs av proteiner som dynamiskt monterar makromolekylärt komplex, är identifiering av protein-protein interaktioner (PPI) en viktig strävan i biomedicinsk forskning. Faktiskt, PPI är ofta avregleras i sjukdom och representerar potentiella mål för therapeutics1. Mest använda metoden för identifiering av PPI är metoden affinitet rening (AP) som, efter cellys, ett protein av intresse renas specifikt på en matris och associerade proteiner identifieras senare av masspektrometri (MS). AP-MS är en kraftfull metod, utför det vanligtvis inte bra på dåligt lösligt proteinkomplex, mycket övergående interaktioner eller PPI som kräver en intakt subcellulär struktur. Tolkningen av data kan dessutom kompliceras av den dynamiska karaktären av PPI nätverk, som ett enda protein är ofta en del av flera olika proteinkomplex.
Närhet-märkning tekniker såsom BioID2 eller APEX23,4 utvecklades nyligen för att ta itu med några av begränsningarna av AP-MS metoder. I BioID katalyserar enzymet BirA * (motsvarande en G115R variant av enzymet vildtyp E. coli ) bildandet av labila biotinyl-AMP (bio-AMP) som kan reagera med primära aminer. I motsats till enzymet vildtyp, som behåller bio-AMP i dess aktivet centrerar, släpper BirA * bio-AMP så att dess spridning till dess närliggande miljö. Därför, när smält till ett protein av intresse och uttryckt i celler, proximala proteiner kan vara biotinylerade inom en beräknad räckvidd 10 nm5. Dessa markerade proximala proteiner sedan isoleras genom streptividin pulldown och identifieras av MS. I motsats till AP-MS kräver BioID ett uttryck för ett fusionsprotein. Det kan således endast tillämpas på proteiner vars funktion inte hämmas av taggning. Dessutom hastighet märkning är långsam, vanligen 6 – 24 h2,6, att göra detektion av kortlivade proteiner utmanande. Ändå, jämfört med AP-MS, BioID-MS erbjuder flera viktiga fördelar: första, dess fångar interaktioner i deras infödda cellulära miljön; andra, märkta proteiner i stället för monterade komplex isoleras efter cellys; tredje kan streptividin pulldowns använda denatureringen buffertar och hårda tvätt villkor. Metoden är därför mer känsliga att upptäcka övergående eller svaga interaktioner7 eller interaktioner som inträffar på en specifik och svårt att isolera subcellulär struktur8.
De flesta proteiner ingår dock vanligen i större komplex som kan renovera enligt cellulära signaler eller till funktionen som behöver utföras. Ett enda protein är därför vanligtvis en del av flera komplex, motsvarar olika funktionella enheter, som innebär tydliga eller överlappande PPI. Båda metoderna ger en översikt över alla föreningar ett visst protein kan ha, men de misslyckas med att ta itu med ramen för enskilda PPI. För att öka upplösningen på den senare, har vi utformat en protein-fragment komplettering assay (PCA) i vilken två inaktiva fragment av BirA * (NBirA *, som innehåller den katalytiska domänen, och CBirA * som kan ses som re-aktiveringen domän) kan återmontera till ett aktivt enzym när förde i närheten av två interagerar proteiner9. Resulterande split-BioID analysen fokuserar den närhet-beroende biotinylation på proteiner som samlas kring ett par av samverkande proteiner och därmed möjliggör identifiering av sammanhang beroende protein församlingar. Vi har nyligen visat enastående upplösning makt split-BioID genom att lösa två distinkta proteinkomplex inblandade i miRNA-medierad nedtystning väg9.
Sammantaget i en enda, enkel analys tillåter split-BioID att upptäcka och uttryckligen tilldela PPI till definierade funktionella enheter där ett visst protein är inblandade, förutsatt att en ytterligare samverkande protein av motsvarande protein komplex är känd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td>To make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution 25% NH3</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>6012</td>
			<td>To dissolve biotin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9518</td>
			<td>To select transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor plus sonification device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Other sonification devices are also ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td>To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076</td>
			<td>Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Ultra reagent</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BFU05L</td>
			<td>Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99002</td>
			<td>Any other model is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td>If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA miniprep kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2951</td>
			<td>Dox is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2948</td>
			<td>Make 1M stock solution, store at -20 &#176;C and always use fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 680-conjugated streptavidin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21848</td>
			<td>to use with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A5097</td>
			<td>Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32205</td>
			<td>Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td>To adjust pH of biotin stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763</td>
			<td>Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td>12083</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>Any other transfection reagent is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145</td>
			<td>To block Western blot membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3198</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 10% (w/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31434</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (Nonidet P40 substitute)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>To wash cells before scrapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Added to the lysis buffer to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90003</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90004</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90008</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90009</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0555S</td>
			<td>To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 4-20% SDS precast gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG42012</td>
			<td>To use when running samples for MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue LDS Sample Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB31010</td>
			<td>Running buffer for the RunBlue precast gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5030</td>
			<td>Comes as a 20% stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tet-free serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181T</td>
			<td>we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855</td>
			<td>Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127</td>
			<td>Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split-bioid &#8212; proteomic analysis of context-specific protein complexes in their native cellular environment

För att komplettera befintliga affinitet rening (AP) metoder för identifiering av protein-protein interaktioner (PPI), enzymer har införts som tillåter närhet-beroende märkning av proteiner i levande celler. Ett sådant enzym, BirA * (används metoden BioID), förmedlar biotinylation av proteiner inom ett område på cirka 10 nm. Därför, när smält till ett protein av intresse och uttryckt i celler, kan märkning av proximala proteiner i sin ursprungliga miljö. I motsats till AP som bygger på rening av monterade proteinkomplex, upptäcker BioID proteiner som har markerats i celler oavsett om de fortfarande interagerar med proteinet av intresse när de är isolerade. Eftersom det biotinylates proximala proteiner, en kan dessutom dra nytta av streptividin för biotin att mycket effektivt isolera dem enastående affinitet. Medan BioID presterar bättre än AP för identifierande övergående eller svaga interaktioner, ger båda AP - och BioID-mass spectrometry metoderna en översikt över alla möjliga interaktioner ett visst protein kan ha. De ger dock inte information på ramen för varje identifierad PPI. De flesta proteiner är faktiskt normalt en del av flera komplex, motsvarande tydlig mognad steg eller olika funktionella enheter. För att lösa denna gemensamma begränsning av båda metoderna, har vi konstruerat en protein-fragment komplettering analys baserat på enzymet BirA *. I denna analys, kan två inaktiva fragment av BirA * sätt ihop till ett aktivt enzym när förde i närheten av två samverkande proteiner som de smälts. Den resulterande split-BioID assay tillåter således märkning av proteiner som samlas kring ett par av samverkande proteiner. Förutsatt dessa två samverkar endast i ett visst sammanhang, gör split-BioID sedan analysen av specifika innehållsberoende funktionella enheter i deras infödda cellulära miljön. Här, ger vi en steg för steg-protokollet för att testa och tillämpa split-BioID till ett par av samverkande proteiner.

För att illustrera hur denna metod fungerar, öppna läsning ramar (ORFs) av proteiner Ago2, var TNRC6C och Dicer (alla inblandade i den miRNA-medierad nedtystning väg) klonad i split-BioID plasmider. Ago2 är kända för att interagera med TNRC6C inom ett miRNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplex (miRISC) som förtrycker översättning och stimulera förfalla av målet mRNA14. Före att montera miRISC, Ago2 interagera med Dicer, det enzym som producerar mogen MicroRNA, i ett komplex där den kan få laddad med en miRNA15. Split-BioID tillämpades därför antingen Ago2/Dicer paret eller Ago2/TNRC6C paret. För varje par av testade proteiner var Ago2 antingen smält NBirA * eller CBirA * använda vår split-BioID plasmider (figur 2) och Dicer och TNRC6C till den motsvarande cognate BirA * fragment. Dessutom varje protein var smält till CBirA * och ihopkopplad med en NBirA *-GFP fusion som en negativ kontroll. Detta resulterar i att testa fyra iterationer för varje par av testade protein (tabell 1).
För att testa om split-BioID aktiveras vid växelverkan av para av testade proteiner, följde vi den ordningen som avbildas på figur 1. Plasmidsna var övergående transfekterade i en tet-system kompatibelt HeLa cellinje. Uttrycket av fusionsproteinerna förmåddes med doxycyklin (dox) och biotinylation stimulerades genom att lägga till överskott biotin odlingsmedium. Efter en 20 h inkubationstiden med dox och biotin, celler var lyserat och analyseras av Western blotting med konjugerad streptividin att upptäcka biotinylerade proteiner. I däggdjursceller, två stora band upptäcks vanligen av den konjugerade streptividin i untransfected provet (figur 3, stjärnor) och motsvarar endogent biotinylerade proteiner (troligen mitokondriella carboxylases). Dessa två band är närvarande i alla prover och bekvämt kan användas som intern lastning kontroller, upptäckt av en städning protein att styra lastning av lika protein belopp är således överflödig. Typiskt för en BioID/split-BioID experiment, de extra stora band som kan observeras är fusionsproteinerna som fick self-biotinylerade. Även om inga andra biotinylerade protein ses, anger att upptäcka biotinylation av fusionsproteinerna i detta skede redan att de två testa proteinerna samverkade i cellerna. I experimentet avbildad på figur 3, det är klart att ha en NBirA *-Ago2 fusionsprotein parad med CBirA * fusioner till TNRC6C eller Dicer är effektivare än de motsatta kombinationerna i som CBirA *-Ago2 kopplas till NBirA * fusioner av de andra två proteiner (figur 3, övre panelen, jämför stödnivåerna körfält 2-3 till lanes 6-7). Aktiveringen var dessutom specifika som ingen av de CBirA * fusioner kunde aktivera den NBirA *-GFP kontroll fusionsprotein till märkbara nivåer (figur 3, jämför körfält 1, 4-5 till lane 8 som motsvarar untransfected celler). Eftersom i våra plasmider, NBirA * har en myc-tagg och CBirA * har en flagga tagg (figur 2), kan uttrycksnivåerna för varje fusionsprotein analyseras med antikroppar mot dessa två Taggar (figur 3, nedre panelen).
När interaktion-inducerad biotinylation observeras, experimentet kan skalas upp och de biotinylerade proteinerna isolerade på streptividin-kopplade pärlor som anges i punkt 4 i protokollet (figur 4). När du utför isolering första gången, kan alla steg i reningen analyseras med Western blotting (figur 5). Normalt bindande till pärlorna ska vara nästan kvantitativa och praktiskt taget inget läckage genom bör observeras i tvättarna. Före bearbetning proverna för masspektrometri, rekommenderar vi kör en Western blot för att säkerställa inducerad-biotinylation fungerade som förväntat och att fusionsproteinerna uttrycktes. Avsaknaden av uttryck av fusionsproteinerna är antingen på grund av dålig transfection effektivitet eller felaktiga dox induktion. Om fusionsproteinerna uttrycktes men ingen biotinylation observeras, kontrollera om överskott biotin (50 μM) faktiskt lades till medium och att de lager biotin är fortfarande aktiv. När eluerade materialet analyseras på en Coomassie-färgade protein gel (figur 6), vanligtvis, det starkaste bandet ska observeras körs på cirka 17 kDa och motsvarar monomer streptividin. Band som motsvarar de endogena biotinylerade proteinerna och fusionsproteinerna kan också observeras. Vi punktskatt vanligtvis området av provet lane ovan streptividin bandet upp till lastning väl (figur 6). Exciderad bandet kan lagras i ett 1,5 mL rör och skickas till en anläggning för masspektrometri. Alternativt, bundna proteiner kan också vara trypsin-rötas på streptividin-kopplade pärlor och smält peptiderna elueras bilda kolumnen. Vi använder rutinmässigt MaxQuant programvara16 (som mestadels standardparametrar och lägga till lysin biotinylation som ett möjligt posttranslationella modifieringen, se hänvisning 9 för mer detaljer och typiska MS resultat) att analysera MS rådata och Perseus suite17 för efterföljande statistisk analys, båda är fri programvara. Prover är vanligtvis kör i tre biologiska replikat. Använder etikett-fri kvantifiering, kan speciellt anrikade proteiner identifieras över villkor som kontroll. För att filtrera för endogent biotinylerade proteiner och proteiner som är icke-specifikt märkta av enzymet BirA *, anser vi bara proteiner som är avsevärt berikad över träffar från sex datamängder som genereras med sex orelaterade proteiner. Dessutom anser vi endast träffar som är berikad över en split-BioID datamängd som NBirA * fusionsproteinerna har ersatts av NBirA *-GFP. Andra strategier för analys av data har föreslagits särskilt med hjälp av stabila isotoper märkning med aminosyror i cellkultur (SILAC) för kvantitativ proteomik18. Dessutom har olika strategier beskrivits för direkta isolering av biotinylerade peptider med en streptividin variant med försvagade affinitet till biotin18, särskilda eluering förhållanden med hjälp av organiska lösningsmedel19 eller biotin-specifika antikroppar20,21. Samtidigt inte nödvändigtvis leder till upptäckten av flera proteiner, identifiering av biotinylation platser tillsätt mer förtroende när det gäller specificitet träffar och användbar när behandlar topologin för en interaktion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg"> Figur 1: översikt över förfarandet för split-BioID. Protein 1 samverkar med protein 2 som en del av komplexa A eller med protein 3 som en del av komplexa B. För att speciellt undersöka sammansättningen av komplexa A, kan split-BioID tillämpas på proteiner 1 och 2. Fotografiet av masspektrometer under en Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported licens och hämtades från https://commons.wikimedia.org med filnamn som ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg"> Figur 2: uttryck kassetter av split-BioID plasmidsna. Vi erbjuder fyra plasmider för att testa alla kombinationer av NBirA * och CBirA * fusionsproteinerna. De plasmider och kompletta kartor finns på addgene.org under indikerad numrerar. Plasmidsna ha tet-responsive element (7 x tetO) och behöver användas i en cellinje som är kompatibel med systemet tet uttryck. Observera också att i alla plasmider den ORFs av FKBP och FRB är smält till de NBirA * och CBirA * fragment respektive. Dessa två proteiner samverkar endast i närvaro av rapamycin och därmed plasmidsna kan användas för att snabbt testa systemet i närvaron eller frånvaron av detta kemiska9. De angivna begränsningen platserna är unika. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg"> Figur 3: typisk Western blot för en split-BioID experiment. Övre panelen: detektion av biotinylerade proteiner med fluorescently märkta streptividin. Nedre panelen: Påvisande av fusionsproteinerna med anti Myc och anti-Flag antikroppar. Två par av proteiner testades: Ago2/TNRC6C och Ago2/Dicer. I körfält 2 & 3, var Ago2 bifogas CBirA * fragmentet. Lanes 6 & 7, var Ago2 bifogas NBirA * fragmentet. Ingen betydande signal observerades när någon av de tre proteinerna kombinerades med NBirA *-GFP (körfält 1, 4-5). Stjärnorna visar de banden som motsvarar endogent biotinylerade proteiner som kan fungera som intern lastning kontroller. Denna siffra är anpassade från figur 5B i Schopp o.a. 9 under en Creative Commons Attribution 4.0 International licens. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg"> Figur 4: översikt över förfarandet för streptividin-pulldown. Stora steg för isolering av biotinylerade proteiner för masspektrometri analys skildras. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg"> Figur 5: typisk Western blot för ett experiment med streptividin i pulldown. Lika volymer av varje indikerade prov lastades på en SDS-Polyakrylamidgelen. Efter Western blotting, biotinylerade proteiner påvisades med HRP-kopplade streptividin. Band som motsvarar NBirA *-TNRC6C och CBirA *-Ago2 indikeras. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg"> Figur 6: typiska Coomassie-färgade protein gel för masspektrometri analys. De eluerade provet från streptividin-kopplade pärlor var lastat på en prefabricerad protein gel och kör tills provet migrera 2-3 cm. Det stora bandet sett på cirka 17 kDa är streptividin. Området direkt ovanför det bandet är censurerade och skickas till en anläggning för masspektrometri. Band som motsvarar NBirA *-TNRC6C och CBirA *-Ago2 indikeras. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transfection prov</td>
			<td colspan="3">Villkoret testas</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">ingen transfection</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Testade normalt villkor när du tillämpar split-BioID på två proteiner.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sekvensering primer</td>
			<td>sekvens</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kassett 1 reverse primer (CBirA * fusion)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kassett 2 reverse primer (NBirA * fusion)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Sekvensering primers för split-BioID plasmidsna.

Watch this Scientific Journal Video about Split-BioID Ã¢â‚¬â€ Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment at JoVE.com

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Vi erbjuder en stegvis protokoll för split-BioID, en protein fragment-komplettering analysen bygger på närhet-märkning teknik BioID. Aktiverad på samspelet mellan två givna proteiner, tillåter det Proteomik analys av innehållsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön. Metoden är enkel, kostnadseffektiv och kräver endast vanlig laboratorieutrustning.

Split-BioID — Proteomiska analys av sammanhangsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifiering av liten molekyl-bindande proteiner i en Native Cellular miljö med Live-cell fotoaffinitetsmärkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Syntes av 1,2-Azaborines och utarbetandet av deras proteinkomplex med T4 Lysozyme mutanter

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinitetsrening av proteinkomplex från eukaryota celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontell gelelektrofores för förbättrad detektion av protein-RNA-komplex

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion av mänskliga näthinnan och RPE-åderhinnan för proteomiska analys

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analys av Thylakoid membran proteinkomplex med blå infödda gelelektrofores

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomiska analys av mänskliga makrofag polarisering Under en låg syrehalt miljö

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...