Name: carip-seq and chip-seq: methods to identify chromatin-associated rnas and protein-dna interactions in embryonic stem cells
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por Wayne estado Universidade, Karmanos Cancer Institute, uma concessão do nacional do coração, pulmão e sangue Institute (1K22HL126842-01A1) atribuído a B.L.K. Este trabalho utilizou o Wayne estado Universidade High Performance Computing Grid para recursos computacionais (< https://www.grid.wayne.edu/>). Agradecemos Jiji Kurup assistência com análise de dados de CARIP-Seq.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES:
B.L.K. concebeu o método de CARIP-Seq, concebidos e realizados os experimentos de ChIP-Seq e CARIP-Seq, analisou os dados de sequenciamento e elaborou o manuscrito. Todos os autores leu e aprovou a versão final deste manuscrito.

1. cultura de Mouse ES células em condições de livre de alimentador.
Nota: As pilhas do rato ES convencionalmente são cultivadas nos meios de comunicação em um prato de cultura celular revestido com gelatina e uma mono-camada de fibroblastos embrionários do mouse (MEF), que foram mitotically inativado (iMEFs). No entanto, MEFs devem ser removidos antes da jusante análises epigenéticas ou expressão para evitar a contaminação do MEF-associado da cromatina e do RNA.
<ol><li>Prepara?...

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells.">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li><li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells.">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li><li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells.">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li><li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b.">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li><li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li><li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure,+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA.">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li><li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression.">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li><li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins.">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28 (2016).</li><li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting.">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li><li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes.">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li><li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation.">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins.">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li><li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+(PMEF)+cultures.">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li><li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryo+fibroblast+(MEF)+feeder+cell+preparation.">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data.">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS)+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells.">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li><li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq:+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data.">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genome+center's+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system.">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li></ol>

ChIP-Seq é um método útil para avaliar o local de interações proteína-ADN global (ex., fatores de transcrição/histona modificando as modificações de histona/enzimas e DNA) em células ES, enquanto o protocolo de CARIP-Seq recentemente desenvolvido é útil em Associação de todo o genoma de RNAs com constituintes de cromatina a interrogar. ChIP-Seq é uma ferramenta fundamental que é usada para avaliar epigenéticas paisagens de pilhas do ES e outros tipos de células. A qualidade do ChIP-Seq e bibli...

Decisões de destino de células estaminais embrionárias (ES) são reguladas pela comunicação entre sinais extracelulares e uma série de reguladores transcricionais, incluindo modificadores de histona e modificação pós-tradução de caudas de histona. Essas interações facilitam a acessibilidade de cromatina e empacotamento da cromatina em um dos dois Estados: eucromatina, que é aberto e transcricionalmente ativo, e heterocromatina, que é compacto e geralmente transcricionalmente inativo. Factores de transcrição com afinidades de ligação de sequência específica de DNA e modificadores epigenéticas associado com as regiões de eucromatina a participar no controle da expressão gênica. Métodos de sequenciamento de próxima geração, incluindo ChIP-Seq1, têm sido fundamentais para mapear todo o genoma redes transcriptional que são fundamentais para ES célula auto-renovação e pluripotência2,3,4 ,5,6. Além disso, enquanto o RNA immunopreciation seguido de próxima geração sequenciamento (RIP-Seq)7 avaliações interações RNA-proteína sugerem que as proteínas de ligação do DNA interagem com RNAs de regulação transcricional eventos7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, poucos estudos têm investigado a localização de todo o genoma de RNAs associados com cromatina12, ou interações globais entre RNA e histona modificações. Há muito tempo não-codificantes RNAs (lncRNAs) são uma classe de RNAs que foram encontrados para regular a atividade de proteínas da cromatina associada13,14,15. Por exemplo, a Xist é um lncRNA que regula, em células de mamíferos femininas, inativação de um cromossomo X, através do recrutamento de repressores epigenéticas16,17. No entanto, o espectro completo de RNAs associados a cromatina é desconhecido. Aqui, descrevemos um protocolo romance, associada a cromatina RNA imunoprecipitação (CARIP) seguido por sequenciamento de próxima geração (CARIP-Seq), para identificar a cromatina associada RNAs em uma base de todo o genoma em pilhas do ES, incluindo a preparação de biblioteca para sequenciamento de nova geração e ChIP-Seq para mapear ocupação global de modificações do histone, fatores de transcrição e epigenéticas modificadores. Ao contrário de outros métodos de RIP-Seq7, CARIP-Seq inclui etapas de reticulação e sonication, que permitem a identificação directa das RNAs associados a cromatina. Juntos, ChIP-Seq é uma poderosa ferramenta para identificar as interações proteína-ADN de todo o genoma, enquanto CARIP-Seq é um método poderoso para o levantamento RNAs associados a componentes de cromatina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>106 or 107 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK3&#946; inhibitor CHIR99021 (GSK3i)</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td></td>
			<td>Solvent: DMSO 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK inhibitor PD0325901 (MEKi)</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td></td>
			<td>Solvent: DMSO 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-009-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td>1.25 M stock conentration in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-011-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution (20%)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A611-0837-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 sonifier</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11917010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-It DNA End-Repair Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>ER81050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP (10 mM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18252015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-gel EX agarose gels, 2%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G402002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F531LPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>17-614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor pico</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01010001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Flurometer 2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labquake rotator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>400110Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq platform</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

carip-seq and chip-seq: methods to identify chromatin-associated rnas and protein-dna interactions in embryonic stem cells

Autorenovação de células estaminais embrionárias (ES) e a diferenciação é regulada por sinais extrínsecos e intrínsecas redes de fatores de transcrição, epigenéticos reguladores e modificações pós-tradução das histonas que combinatóriamente influenciam o gene Estado de expressão de genes nas proximidades. RNA também foi mostrado para interagir com várias proteínas para regular a dinâmica da cromatina e expressão gênica. Associada a cromatina RNA imunoprecipitação (CARIP) seguida por sequenciamento de próxima geração (CARIP-Seq) é um novo método para o levantamento de RNAs associados a proteínas da cromatina, enquanto imunoprecipitação da cromatina, seguido por sequenciamento de próxima geração ( ChIP-Seq) é uma técnica poderosa genômica para mapear a localização de modificação pós-traducional de histonas, fatores de transcrição e modificadores epigenéticas em uma escala global em pilhas do ES. Aqui, descrevemos os métodos para executar CARIP-Seq e ChIP-Seq, incluindo a construção da biblioteca para geração de sequenciamento, para gerar o RNA global associada a cromatina e epigenomic mapas em pilhas do ES.

Interrogámo com êxito a ligação de todo o genoma de H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B em células ES usando este ChIP-Seq protocolo6. ES as células foram cultivadas em condições de livre de alimentador (Figura 1) e reticulado como descrito acima. Sonication posteriormente foi realizada conforme descrito na etapa 3.2 do protocolo ChIP-Seq e avaliado pela execução de DNA em um gel de agarose a 2% (Figura 2)....

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CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Derivação de Cardiac células progenitoras de células estaminais embrionárias

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Biologia do Desenvolvimento

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Um método simples para identificar quinases que regulam a pluripotência de células estaminais embrionárias por meio de triagem de inibidores de alto rendimento

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...