Name: quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af nationale kontorer i sundhed grant RO1 AI067979 til NWA. Gitte er modtager af bachelorstuderende stipendium fra Howard Hughes Medical Institute/universitetet af Maryland College Park.

Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med henstillingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health og blev godkendt af University of Maryland's IACUC. Alle trin beskrevet i afsnit 1-4 foretages under aseptiske forhold inde biologiske laminar flow kabinetter. Personlig beskyttelse bør anvendes, og skal der udvises forsigtighed under håndteringen af levende Leishmania parasitter i alle faser af eksperimenter.
1. iso...

De kvantitative data produceret af BMM infektion assay beskrevet ovenfor, giver mulighed for efterforskerne at indhente priser af infektion og en pålidelig bestemmelse af ændringer i virulens egenskaber i en relativt kortere tidsperiode (maksimalt 2 uger, i forhold til 2 måneder kræves for i vivo forsøg). Denne metode bygger på DNA specifikke farvestoffet DAPI, som specifikt pletter makrofag og parasit kerner, og giver mulighed for hurtig identifikation og kvantificering af inficerede celler. I sammenligni...

Leishmaniasis refererer til et bredt spektrum af sygdomme hos mennesker forårsaget af protozoer parasit arter af slægten Leishmania. Ca. 12 millioner mennesker smittes i øjeblikket med Leishmania på verdensplan, og mere end 350 millioner er truet. Sygdom patologi afhænger af arternes Leishmania og vært faktorer og symptomer varierer fra uskadelige selvhelende hudlæsioner dødbringende visceralizing former. Hvis ubehandlet, visceral leishmaniasis er dødelig, ranking kun efter malaria som de dødeligste sygdom hos mennesker forårsaget af infektion med protozoer parasitten1. På trods af de vidtrækkende forskelle i sygdom patologi og symptomer har alle Leishmania arter en digenic liv-cyklus vekslende mellem promastigote og amastigote stadier i insekt og hvirveldyr værter, henholdsvis. Indersiden hvirveldyr, Leishmania target host makrofager for invasion og inducere dannelse af parasitophorous vacuoles (PVs), sure segmenter med egenskaberne for phagolysosomes hvor de stærkt virulente amastigote former replikere. Amastigotes vedvarer i værten væv under kroniske infektioner og kan være bestået frem til ikke-inficerede sandfluer, fuldfører transmission cyklus. Derfor, i forbindelse med udvikling af human sygdom, amastigotes er den vigtigste Leishmania lifecycle form2. Undersøge hvordan amastigotes replikere indeni makrofag PVs er afgørende for forståelse Leishmania virulens3,4,5,6,7 og for den udvikling af nye effektive behandlinger.
Vi beskriver her en metode, der bruges regelmæssigt af vores laboratorium til at studere Leishmania infektion og replikering i knoglemarv-afledte makrofager (BMMs), der involverer kvantitative vurdering af antallet af intracellulære Leishmania over tid. Processen indebærer høst af monocytter fra mus knoglemarven og differentiering til makrofager i kultur, in vitro- smitte med infektiøs former (metacyclic promastigotes eller amastigotes) Leishmania og kvantificering af den antallet af intracellulære parasitter på hver 24 h interval for en periode på 72-96 h efter infektion. Denne analyse har været brugt i vores laboratorium til at bestemme virkningen af flere miljømæssige faktorer og parasit gener, herunder identifikation af jern kritiske rolle i at fremme L. amazonensis virulens, der yderligere blev valideret af footpad læsion udviklingsstudier mus6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Da alle patogene Leishmania arter fastsætte deres replicative niche inde i værten makrofager, kan dette assay anvendes universelt til virulens bestemmelser i alle Leishmania arter.
Udfører BMM infektioner giver mulighed for analyse af vært-parasit interaktioner på enkelt celle-niveau, og dermed en mere omfattende forståelse af hvordan Leishmania parasitter interagerer med deres foretrukne vært mikromiljø, PVs af makrofager. Makrofag infektion assays er blevet med held brugt af flere grupper16,17,18,19,20,21,22 at udforske funktioner af både vært makrofager og Leishmania specifikke gener og deres potentielle inddragelse i det komplekse samspil, der kendetegner intracellulære infektion. BMM infektioner giver mulighed for kvantificering af parasitten vækst som en udlæsning af virkningen af vært faktorer, der påvirker intracellulære overlevelse, som microbicidal nitrogenoxid produktion, generation af reaktive ilt arter og andre ugunstige forhold stødt inde i lysosomet-lignende PVs23. Makrofag infektion assays har også været udnyttet til at identificere potentielle anti-leishmanial medicin kundeemner for terapeutisk udvikling13,24.
In vitro- arten af BMM infektioner giver flere fordele sammenlignet med andre metoder til at vurdere Leishmania virulens. Flere tidligere studier undersøger mekanismer af intracellulære parasit overlevelse over tid dog ikke kvantificere infektion som en sats20,21,24. Desuden, mange undersøgelser fokuseret på efter i vivo infektioner over tid gjorde det ved at måle kutan læsion størrelse og andre fysiologiske symptomer, der er kun indirekte relateret til parasit replikering25,26 , 27. in vivo infektion er en stringent tilgang til at vurdere parasit virulens, men læsion størrelse målinger baseret på footpad hævelse alene er ofte utilstrækkelige, da de afspejler det inflammatoriske respons i inficeret væv og ikke den absolutte antal af parasitter. Af denne grund, footpad læsion udvikling assays skal følges ved kvantificeringen af parasitten belastning inficeret væv, en procedure, der kræver lange begrænsende fortynding-undersøgelser,28. Desuden, indebærer i vivo undersøgelser ofte, at ofre flere dyr på forskellige punkter i tid til at udtrække væv af interesse6,8,9,10, 11 , 13. derimod stort antal BMMs kan fås fra bare ét dyr, og disse celler kan være forgyldt betingelser, som tillader vurdering af infektion på forskellige punkter i tid. Derudover giver sammenlignes i vivo undersøgelser, udfører in vitro- BMM infektioner større kontrol over forsøgsbetingelser. Kvantificere makrofager at blive smittet med parasitter, selv giver præcis kontrol over mangfoldigheden af infektion (MOI) og dyrkningsbetingelserne. Fin kontrol over disse faktorer kan være nøglen til at identificere karakteristika af diskrete cellulære veje og forstå deres indflydelse på forløbet af infektionen.
Disse fordele er det noget overraskende, at meget få grupper at studere Leishmania virulens hidtil har taget fuld fordel af kvantitativ evaluering af intracellulær replikation i makrofager. I denne artikel vil diskutere vi fælles faldgruber, der kan være hæmmer de mere omfattende udnyttelse af denne analyse, og give en trinvis protokol for at lette dets korrekte gennemførelse. I betragtning af dens præcision og alsidighed, BMM infektion analysen vi beskrive her kan ikke kun udnyttes til at udforske vært-patogen interaktioner påvirke Leishmania virulens, men også at studere andre mikroorganismer, der replikerer inde makrofager29. Vigtigere, kan dette assay også udvikles som en hurtig og økonomisk præklinisk screeningsmetode for anti-leishmanial medicin udvikling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

Livscyklus af Leishmania, det agens af leishmaniasis, veksler mellem promastigote og amastigote stadier i insekt og hvirveldyr værter, henholdsvis. Mens patogene symptomer med leishmaniasis kan variere meget, fra benigne kutane læsioner meget dødelig visceral sygdom former dyrearten infektiøst alle Leishmania arter opholder sig inde i værten makrofager i hvirveldyr fase af deres livscyklus. Leishmania smitteevne er derfor direkte relateret til dens evne til at invadere, overleve og replikere inden for parasitophorous vacuoles (PVs) inde i makrofager. Således fungerer vurderingen af parasittens evne til at replikere intracellulært som en pålidelig metode til bestemmelse af virulens. At studere leishmaniasis udvikling ved hjælp af dyremodeller er tidskrævende, besværligt og ofte vanskelige, især med de pathogenically vigtigt visceral former. Vi beskriver her en metode til at følge den intracellulære udvikling af Leishmania i knoglemarv-afledte makrofager (BMMs). Intracellulære parasit numre bestemmes med 24 timers mellemrum i 72-96 timer efter infektion. Denne metode giver mulighed for en pålidelig bestemmelse af virkningerne af forskellige genetiske faktorer på Leishmania virulens. Som et eksempel viser vi, hvordan et enkelt allel sletning af Leishmania mitokondrie jern Transporter-genet (LMIT1) forringer Leishmania amazonensis mutant stamme LMIT1/ΔLmit1 evne til at vokse inde i BMMs, afspejler en drastisk reduktion i virulens i forhold til wild-type. Denne analyse giver også mulighed for præcis styring af forsøgsbetingelser, der individuelt kan manipuleres til at analysere forskellige faktorer (næringsstoffer, reaktive ilt arter, osv.) indflydelse på vært-patogen interaktion. Derfor, passende udførelse og kvantificering af BMM infektion undersøgelser giver en non-invasiv, hurtig, økonomisk, sikker og pålidelig alternativ til konventionel dyr model undersøgelser.

Leishmania har to infektiøst former - metacyclic promastigotes, der adskiller fra procyklisk promastigotes på den stationære fase af kultur og amastigotes, som er de intracellulære faser (figur 1). I nogle Leishmania arter såsom L. amazonensis, kan amastigotes også være differentieret i axenic kultur ved at flytte promastigote cellerne til at sænke pH (4,5) og forhøjet temperatur (32 ° C), betingelser svarende til dem fund...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Alle patogene Leishmania arter opholde sig og replikere indeni makrofager i deres hvirveldyr værter. Vi præsenterer her, en protokol for at inficere murine knoglemarv-afledte makrofager i kultur med Leishmania, efterfulgt af præcis kvantificering af intracellulære vækst kinetik. Denne metode er nyttig til at studere individuelle faktorer, der påvirker vært-patogen interaktion og Leishmania virulens.

Kvantificering af intracellulære vækst inde makrofager er en holdbar og pålidelig metode til vurdering af virulens i Leishmania parasitter

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En Parasite Rescue og transformationsassay for Antileishmanial Screening mod intracellulære<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoter i THP1 human akut monocytisk leukæmi cellelinje

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fænotypisk analyse til kvantificering af intracellulære mycobakterier tilpasset til screening med højt gennemløb/højt indhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: High-throughput Kvantificering af Colony vækst og Latenstid

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere antisvampeaktivitet Isoleret alveolære makrofager ved konfokal mikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Anvende en Inducerbar Expression System til Studieinformationen Interferens med bakteriel virulensfaktorer med intracellulær signalering

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikation af virulens markører af Mycobacterium abscessus intracellulære replikering i fagocytter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...