Name: quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie RO1 AI067979 NWA. YK is ontvanger van undergraduate fellowship van de Howard Hughes Medical Institute/Universiteit van Maryland College Park.

Alle experimentele procedures werden door de National Institutes of Health uitgevoerd overeenkomstig de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en zijn goedgekeurd door de IACUC van de Universiteit van Maryland. Alle stappen die worden beschreven in de punten 1 tot en met 4 mag aseptisch worden uitgevoerd binnen biologische laminaire flow kasten. Persoonlijke beschermingsmiddelen moet worden gebruikt, en voorzichtigheid moet worden betracht bij de verwerking van levende Leishmania pa...

De kwantitatieve gegevens geproduceerd door de BMM infectie assay hierboven beschreven, kunnen onderzoekers te verkrijgen van de tarieven van de infectie en een betrouwbare bepaling van de veranderingen in virulentie eigenschappen in een relatief korte periode (maximaal 2 weken, in vergelijking met de 2 maanden vereist voor in vivo experimenten). Deze methode is gebaseerd op de DNA-specifieke kleurstof DAPI, die specifiek vlekken macrophage en parasiet kernen, en maakt snelle identificatie en kwantificering van ...

Leishmaniasis verwijst naar een breed spectrum van ziekten bij de mens veroorzaakt door eencellige parasiet soorten van het geslacht Leishmania. Ongeveer 12 miljoen mensen zijn momenteel geïnfecteerd met Leishmania wereldwijd en meer dan 350 miljoen worden bedreigd. De pathologie ziekte hangt af van de soort Leishmania en gastheer factoren en symptomen variëren van onschuldige zelfhelend letsels van de huid tot dodelijke visceralizing vormen. Indien onbehandeld, viscerale leishmaniasis dodelijk is, ranking pas na malaria als de dodelijkste ziekten bij de mens veroorzaakt door infectie met een eencellige parasiet1. Ondanks de brede verschillen in ziekte pathologie en symptomen hebben alle Leishmania soorten een afwisselend promastigote en amastigoot fasen binnen insecten en gewervelde gastheren, respectievelijk digenic-levenscyclus. Binnenkant gewervelde dieren, Leishmania target host macrofagen voor invasie en de vorming van parasitophorous vacuolen (PVs), zure compartimenten met eigenschappen van de phagolysosomes waar de formulieren zeer virulente amastigoot repliceren veroorzaken. Amastigotes aanhouden in gastheer weefsel gedurende chronische infecties en doorsturen naar niet-geïnfecteerde zandvliegjes, kunnen worden doorgegeven als voltooiing van de cyclus van de transmissie. Daarom, in het kader van de ontwikkeling van ziekten bij de mens, amastigotes zijn de belangrijkste Leishmania lifecycle vorm2. Onderzoeken hoe amastigotes repliceren binnen macrofaag PVs is van cruciaal belang voor het begrip Leishmania virulentie3,4,5,6,7 en voor de ontwikkeling van nieuwe werkzame therapieën.
Hier beschrijven we een methode regelmatig gebruikt door ons laboratorium Leishmania infectie en replicatie in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs), waarbij kwantitatieve beoordeling van het aantal intracellulaire Leishmania na verloop van tijd te studeren. Het proces bestaat uit het verzamelen van monocyten van muis beenmerg en differentiatie macrofagen in cultuur, in vitro besmetting met infectieuze formulieren (metacyclische promastigoten of amastigotes) van Leishmania en kwantificering van de aantal intracellulaire parasieten op elk interval van 24 uur gedurende een periode van 72-96 uur na infectie. Deze test is gebruikt in ons laboratorium om te bepalen van het effect van verscheidene milieufactoren en parasiet genen, met inbegrip van identificatie van de kritische rol van ijzer bij de bevordering van L. amazonensis virulentie verder werd gevalideerd door de struikrover laesie ontwikkelingsstudies in muizen6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Aangezien alle pathogene Leishmania soorten hun Dr. niche binnen host macrofagen stellen, kan deze test universeel worden gebruikt voor de analyse van de virulentie in alle Leishmania soorten.
Uitvoeren van BMM infecties kan analyse van gastheer-parasiet interacties op het niveau van eencellige, en dus een uitgebreider begrip van de wisselwerking tussen Leishmania parasieten en hun voorkeur host-communicatie, de PVs van macrofagen. Macrophage infectie testen zijn met succes gebruikt door meerdere groepen16,17,18,19,20,21,22 te verkennen functies van zowel de host macrofaag Leishmania specifieke genen en hun mogelijke betrokkenheid bij de complexe wisselwerking die kenmerkend intracellulaire infectie. BMM infecties toestaan kwantificering van de groei van de parasiet als een uitlezing van de invloed van gastheer factoren die van invloed zijn intracellulair overleven, zoals microbicidal stikstofmonoxide productie, generatie van reactieve zuurstof soorten en andere ongunstige omstandigheden opgetreden binnen het lysosoom-achtige PVs23. Macrophage infectie testen hebben ook gebruikt ter identificatie van potentiële anti-Leishmania drug leads voor therapeutische ontwikkeling13,24.
De in vitro -aard van de BMM infecties biedt diverse voordelen ten opzichte van andere methoden voor het beoordelen van Leishmania virulentie. Verscheidene vorige studies onderzoeken mechanismen van intracellulaire parasiet overleven na verloop van tijd heeft echter niet kwantificeren infectie als een tarief20,21,24. Bovendien, vele studies gericht op de volgende in vivo infecties na verloop van tijd gedaan door het meten van de grootte van de cutane laesie en andere fysiologische symptomen die slechts indirect gerelateerd zijn aan de parasiet replicatie25,26 , 27. in vivo infectie is een strenge aanpak om te beoordelen van de virulentie van de parasiet, maar laesie grootte metingen gebaseerd op struikrover alleen zwelling zijn vaak ontoereikend, omdat ze de inflammatoire respons in geïnfecteerde weefsels weerspiegelen en niet de absolute aantal parasieten. Om deze reden, struikrover laesie ontwikkeling testen moeten worden gevolgd door de kwantificering van de parasiet belasting in geïnfecteerde weefsels, testen een procedure waarvoor langdurige beperkende verdunning28. Daarnaast betrekken in vivo studies vaak offeren meerdere dieren op verschillende punten in de tijd om uit te pakken van weefsels van belang6,8,9,10, 11 , 13. daarentegen grote aantallen BMMs van slechts één dier kan worden verkregen, en deze cellen kunnen verguld worden onder voorwaarden die het mogelijk maken van beoordeling van infectie op verschillende momenten in de tijd. Voorts staat ten opzichte van in vivo studies, uitvoeren van in vitro BMM infecties meer controle over de proefomstandigheden. Kwantificeren van de macrofagen besmet samen met de parasieten zich maakt nauwkeurige controle van de veelheid van infectie (MOI) en kweekomstandigheden. Fijne controle over deze factoren kunnen zijn belangrijk bij het identificeren van de kenmerken van discrete cellulaire routes en in het begrip van hun effect op het verloop van de infectie.
Gezien deze voordelen, is het enigszins verrassend dat zeer weinig groepen bestuderen van Leishmania virulentie volledig voordeel van de kwantitatieve beoordeling van intracellulaire replicatie tot nu toe hebben genomen in macrofagen. In dit artikel bespreken we gemeenschappelijke valkuilen die kunnen worden belemmert het uitgebreider gebruik van deze bepaling, en een stapsgewijze protocol om de juiste uitvoering te vergemakkelijken. Gezien haar precisie en veelzijdigheid, de BMM infectie assay we hier beschrijven kan niet alleen worden gebruikt om te verkennen van de gastheer-pathogeen interacties Leishmania virulentie te beïnvloeden, maar ook om te studeren van andere micro-organismen die repliceren binnen macrofagen29. Nog belangrijker is, kan deze bepaling ook worden ontwikkeld als een snelle en voordelige preklinische screeningsmethode voor anti-Leishmania Geneesmiddelenontwikkeling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

De levenscyclus van Leishmania, de verwekker van leishmaniasis, afwisselend promastigote en amastigoot fasen binnen de insecten en gewervelde gastheren, respectievelijk. Terwijl pathogene symptomen van leishmaniasis sterk, van goedaardige cutane letsels aan zeer dodelijke viscerale ziekte naar gelang van de infectieuze soorten, vormen variëren kunnen alle Leishmania soorten zich bevinden binnen de gastheer macrofagen in de gewervelde fase van hun levenscyclus. Leishmania infectiviteit is dus direct gerelateerd aan haar vermogen om vallen, overleven en repliceren binnen parasitophorous vacuolen (PVs) in macrofagen. Dus fungeert beoordelen of de parasiet de bekwaamheid om te repliceren intracellulair als een betrouwbare methode voor het bepalen van de virulentie. Bestuderen van leishmaniasis ontwikkelen met behulp van diermodellen is tijdrovend, vervelend en vaak moeilijk, met name met de pathogenically belangrijk viscerale vormen. Hier beschrijven we een methodologie om de intracellulaire ontwikkeling van Leishmania in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs) volgen. Intracellulaire parasiet aantallen zijn vastgesteld op 24u tijdstippen gedurende 72-96 uur na infectie. Deze methode zorgt voor een betrouwbare bepaling van de effecten van verschillende genetische factoren op Leishmania virulentie. Als voorbeeld, laten we zien hoe een één allel schrapping van de Leishmania mitochondriale ijzer Transporter gen (LMIT1) belemmert het vermogen van de Leishmania amazonensis gemuteerde stam LMIT1/ΔLmit1 om te groeien binnen de BMMs, Als gevolg van een drastische vermindering in virulentie in vergelijking met wild-type. Deze test maakt ook nauwkeurige controle van de proefomstandigheden, die individueel kan worden gemanipuleerd om het analyseren van de invloed van verschillende factoren (voedingsstoffen, reactieve zuurstof soorten, enz.) op de host-pathogen interactions. Daarom bieden de juiste uitvoering en kwantificering van BMM infectie studies een niet-invasieve, snel, voordelig, veilig en betrouwbaar alternatief voor conventionele diermodel studies.

Leishmania heeft twee besmettelijk vormen - metacyclische promastigoten die onderscheiden van procyclische promastigoten in stationaire fase van cultuur en amastigotes, die de intracellulaire stadia (Figuur 1). In sommige Leishmania soorten zoals L. amazonensis, kan amastigotes ook worden onderscheiden in een cultuur door het verschuiven van de promastigote cellen lagere pH (4.5) en verhoogde temperatuur (32 ° C), voorwaarden die v...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Alle pathogene Leishmania soorten zich bevinden en repliceren in macrofagen van hun gewervelde gastheren. Hier presenteren we een protocol om te infecteren lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen in cultuur met Leishmania, gevolgd door precieze kwantificering van intracellulaire groei kinetiek. Deze methode is handig voor het bestuderen van de afzonderlijke factoren beïnvloeden host-pathogen interactions en Leishmania virulentie.

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo imaging van transgene Leishmania parasieten in een Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: High-throughput Kwantificering van Colony Groei en vertraging

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...