Name: quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de la subvention RO1 AI067979 de la santé à RNF. YK est récipiendaire de la bourse de premier cycle de l’Howard Hughes Medical Institute de l’Université du Maryland à College Park.

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux recommandations du guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire par le National Institutes of Health et ont été approuvés par l’Université du Maryland IACUC. Toutes les étapes décrites dans les sections 1 à 4 devraient être effectués aseptiquement à l’intérieur des hottes à flux laminaire biologique. Protection individuelle doit être utilisée, et il faut être prudent lors de la manipulation de Leishmania ...

Les données quantitatives produites par l’essai d’infection BMM décrit ci-dessus, permet aux enquêteurs d’obtenir des taux d’infection et une détermination fiable des changements dans les propriétés de virulence dans un laps de temps relativement court (maximum 2 semaines, par rapport à la 2 mois nécessaires pour des expériences in vivo ). Cette méthode s’appuie sur le colorant spécifique de l’ADN DAPI, qui précisément les taches noyaux macrophage et parasite et permet une identification...

La leishmaniose se réfère à un large éventail de maladies humaines causées par les espèces de protozoaire parasite du genre Leishmania. Environ 12 millions de personnes sont actuellement infectées par Leishmania dans le monde entier, et plus de 350 millions sont menacés. La pathologie de la maladie dépend de l’espèce de Leishmania et facteurs de l’hôte, et symptômes varient d’innofensif auto guérison des lésions cutanées aux formes visceralizing mortelles. Si non traitée, viscérale de la leishmaniose est fatale, rang seulement après le paludisme comme la plus meurtrière maladie humaine causée par une infection par un protozoaire parasite1. En dépit des différences de grande envergure dans la pathologie de la maladie et les symptômes, toutes les espèces de Leishmania ont un cycle de digéniques alternant entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et les hôtes vertébrés, respectivement. Intérieur vertébrés, Leishmania ciblent les macrophages hôtes pour invasion et induisent la formation de vacuoles parasitophore (PVs), compartiments acides avec les propriétés des phagolysosomes où les formes hautement virulente amastigote répliquent. Amastigotes persistent dans les tissus de l’hôte lors d’infections chroniques et peuvent être passés vers des phlébotomes, complétant le cycle de transmission. Par conséquent, dans le contexte du développement de la maladie humaine, amastigotes sont le plus important Leishmania lifecycle formulaire2. Étudier comment les amastigotes se reproduire à l’intérieur de macrophages PVs est essentiel pour comprendre Leishmania virulence3,4,5,6,7 et la développement de nouveaux traitements efficaces.
Nous décrivons ici une méthode régulièrement utilisée par notre laboratoire pour étudier les maladies infectieuses Leishmania et réplication dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs), qui prévoit une évaluation quantitative du nombre d’intracellulaire Leishmania au fil du temps. Le processus implique la récolte des monocytes de moelle osseuse de souris et de la différenciation à macrophages en culture, in vitro l’infection avec des formes infectantes (promastigotes métacycliques ou amastigotes) de Leishmania et quantification de la nombre de parasites intracellulaires à chaque intervalle de 24h pour une période de 72-96 h après l’infection. Ce test a été utilisé dans notre laboratoire pour déterminer l’effet de plusieurs facteurs environnementaux et les gènes parasites, y compris l’identification du rôle crucial de fer dans la promotion de L. amazonensis virulence qui a été également validé par coussinet plantaire études de développement de lésions en souris6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Étant donné que toutes les espèces de Leishmania pathogènes établissent leur niche réplicative à l’intérieur de macrophages de l’hôte, ce test peut être utilisé universellement pour les déterminations de la virulence chez toutes les espèces de Leishmania .
Effectuant des infections BMM permet l’analyse des interactions hôte-parasite au niveau de la cellule unique et donc une plus vaste compréhension de comment les parasites Leishmania interagissent avec leur microenvironnement hôte préféré, le PVs des macrophages. Macrophage infection dosages ont été utilisées avec succès par plusieurs groupes16,17,18,19,20,21,22 à explorer fonctions de macrophage hôte et Leishmania de gènes spécifiques et leur implication potentielle dans les interactions complexes qui caractérise l’infection intracellulaire. Les infections BMM permettent la quantification de la croissance du parasite comme une lecture de l’impact des facteurs de l’hôte qui influencent la survie intracellulaire, tels que la production d’oxyde nitrique microbicide, génération d’espèces réactives de l’oxygène et autres conditions défavorables rencontrés dans le lysosome type PVs23. Macrophage infection essais ont également été utilisés pour identifier prospects de drogue anti-leishmanies potentiels pour le développement de thérapeutiques13,24.
Le caractère in vitro des infections BMM offre plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes pour évaluer la virulence de Leishmania . Cependant, plusieurs études antérieures, examen des mécanismes de survie du parasite intracellulaire au fil du temps n’ont pas quantifié l’infection comme un taux de21,20,24. En outre, beaucoup d’études axé sur le suivi des infections in vivo au fil du temps l’a fait en mesurant la taille des lésions cutanées et autres symptômes physiologiques qui ne sont qu’indirectement liées au parasite réplication25,26 , 27. in vivo de l’infection est une approche rigoureuse pour évaluer la virulence du parasite, mais les mesures de taille de lésion basées sur coussinet plantaire gonflement seul sont souvent insuffisantes, car elles reflètent la réponse inflammatoire dans les tissus infectés et pas la nombre absolu de parasites. Pour cette raison, le développement des lésions coussinet plantaire dosages doivent être suivies par la quantification de la charge parasitaire dans les tissus infectés, une procédure qui exige la dilution limite longue tests28. En outre, des études in vivo impliquent souvent sacrifier plusieurs animaux à différents points dans le temps pour en extraire des tissus d’intérêt6,8,9,10, 11 , 13. en revanche, un grand nombre de BMMs peut être obtenu d’un seul animal, et que ces cellules peuvent être plaqués dans des conditions qui permettent l’évaluation d’infection à divers points dans le temps. En outre, par rapport aux études in vivo , effectuant des infections in vitro BMM permet une plus grande maîtrise des conditions expérimentales. Quantifier les macrophages infectés ainsi que les parasites permet un contrôle précis de la multiplicité d’infection (MOI) et des conditions de culture. Contrôle précis sur ces facteurs peut être la clé dans l’identification des caractéristiques des voies cellulaires discrets et dans la compréhension de leur impact sur l’évolution de l’infection.
Compte tenu de ces avantages, il est quelque peu surprenant que très peu étudient des Leishmania virulence ont jusqu'à présent pleinement tiré profit de l’évaluation quantitative de réplication intracellulaire dans les macrophages. Dans cet article, nous discutons des pièges communs qui peuvent être gênant l’utilisation plus étendue de ce test et fournir un protocole étape par étape pour faciliter son application correcte. Compte tenu de sa précision et la polyvalence, le dosage d’infection BMM que nous décrivons ici peut non seulement servir d’explorer les interactions hôte-pathogène qui influent sur la virulence de la leishmaniose , mais aussi d’étudier d’autres microorganismes qui reproduisent à l’intérieur macrophages29. Ce qui est important, ce dosage peut également être développé comme une méthode de dépistage pré-clinique rapide et économique pour le développement de médicaments anti-leishmanies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

Le cycle de vie de Leishmania, l’agent causal de la leishmaniose, alterne entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et vertébrés hôtes, respectivement. Alors que les symptômes pathogènes de la leishmaniose peuvent varier considérablement, de lésions cutanées bénignes aux formes hautement mortelle maladie viscérale selon l’espèce infectieux, toutes les espèces de Leishmania résident à l’intérieur de macrophages de l’hôte pendant l’étape de vertébrés du leur cycle de vie. Leishmania infectiosité est donc directement liée à sa capacité à envahir, de survivre et de répliquer dans les vacuoles parasitophore (PVs) à l’intérieur des macrophages. Ainsi, évaluer la capacité du parasite à répliquer intracellulairement sert une méthode fiable pour déterminer la virulence. Étudier le développement de la leishmaniose à l’aide de modèles animaux est long, fastidieux et souvent difficile, en particulier avec les formes viscérales rôle importants. Nous décrivons ici une méthodologie pour suivre le développement intracellulaire de Leishmania dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs). Nombre de parasites intracellulaires est déterminés à intervalles de 24 h pour 72-96 h après l’infection. Cette méthode permet une détermination fiable des effets de divers facteurs génétiques sur la virulence de Leishmania . À titre d’exemple, nous montrons comment une délétion seul allèle du gène Mitochondrial transporteur de fer Leishmania (LMIT1) porte atteinte à la capacité de la souche mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 à pousser à l’intérieur de BMMs, soit une réduction drastique dans la virulence par rapport au type sauvage. Ce dosage permet également un contrôle précis des conditions expérimentales, qui peuvent être manipulés individuellement pour analyser l’influence de divers facteurs (nutriments, espèces réactives de l’oxygène, etc.) sur l’interaction hôte-pathogène. Par conséquent, l’exécution appropriée et la quantification des études d’infection BMM fournissent une alternative non invasive, rapide, économique, sécuritaire et fiable pour les études sur des modèles animaux conventionnels.

Leishmania a deux formes infectantes - promastigotes métacycliques qui différencient des promastigotes procycliques à la phase stationnaire de la culture et les amastigotes, qui sont les stades intracellulaires (Figure 1). Chez certaines espèces de Leishmania comme L. amazonensis, amastigotes peuvent également être différenciés en culture axénique en déplaçant les cellules promastigote pour abaisser le pH (4.5) et des tem...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Toutes les espèces pathogènes de Leishmania résident et répliquent à l’intérieur de macrophages de leurs hôtes vertébrés. Nous présentons ici un protocole pour infecter les macrophages dérivés de la moelle osseuse souris dans la culture avec la Leishmania, suivie d’une quantification précise de la cinétique de croissance intracellulaire. Cette méthode est utile pour l’étude des facteurs individuels qui influencent l’interaction hôte-pathogène et la virulence de Leishmania .

Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

L&#39;imagerie in vivo des parasites Leishmania transgéniques dans un hôte en direct

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Recherche

Immunologie et infection

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protocole pour la production d&#39;un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Un test Parasite sauvetage et à la transformation pour le dépistage anti-leishmaniose contre intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes dans THP1 humaines ligne leucémie aiguë monocytaire cellulaire

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: haut débit Quantification de Colony croissance et décalage

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

L&#39;application d&#39;un système d&#39;expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification de marqueurs de Virulence de Mycobacterium abscessus de réplication intracellulaire dans les Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...