Name: quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק RO1 AI067979 NWA. YK היא זוכת מלגת תואר ראשון מ הווארד יוז המכון/האוניברסיטה הרפואית של מרילנד קולג פארק.

כל ההליכים ניסיוני נערכו בהתאם להמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים ואושרו על-ידי IACUC של אוניברסיטת מרילנד. כל השלבים המתוארים בסעיפים 1 עד 4 צריכה להתבצע גילוח ורחיצה כירורגית בתוך למינאריים ביולוגי. הגנה אישית אמור לשמש, יש לנקוט זהירות בעת טיפול מ...

הנתונים הכמותיים המיוצר על ידי זיהום BMM וזמינותו שתוארה לעיל, מאפשר חוקרים כדי להשיג את המחירים של זיהום ונחישות אמין של שינויים במאפייני התקפה אלימה בתוך פרק זמן קצר יחסית (מקסימום 2 שבועות, בהשוואה ל- 2 חודשים הדרושים לניסויים ויוו ). שיטה זו מתבססת על ה-DNA ספציפיים לצבוע דאפי, במיוחד כ?...

שושנת יריחו מתייחס לקשת רחבה של מחלות האדם הנגרמת על ידי טפילים protozoan מינים של הסוג לישמניה. כ- 12 מיליון אנשים נגועים כרגע לישמניה ברחבי העולם, בלמעלה מ-350 מליון נמצאות בסיכון. המחלה פתולוגיה תלוי על מינים לישמניה מארח הגורמים, הסימפטומים משתנים בין נגעים בעור ריפוי עצמי לא מזיק לטפסים visceralizing קטלני. אם אינה מטופלת כראוי, מהבטן לישמניה קטלנית, הדירוג רק לאחר מלריה כמו המחלה האנושית הקטלני ביותר הנגרמת על ידי זיהום עם טפילים protozoan1. למרות ההבדלים למחשוב המחלה פתולוגיה ותסמינים, כל המינים לישמניה יש digenic-מחזור חיים לסירוגין בין promastigote ו amastigote שלבים בתוך חרק מארחים חוליות, בהתאמה. בתוך החוליות, לישמניה המטרה המארח מקרופאגים לפלישה, לגרום להיווצרות וקואלות parasitophorous (PVs), תאי חומצי עם המאפיינים של phagolysosomes שבו לשכפל הטפסים amastigote מאוד מידבק. Amastigotes נמשכות ברקמות מארח במהלך זיהומים כרוניים, ניתן להעביר זבובי־חול מצפים נגוע, להשלמת המעגל שידור. לכן, בהקשר של התפתחות מחלות אנושיות, amastigotes הם החשובים ביותר לישמניה מחזור טופס2. חוקר איך לשכפל את amastigotes בתוך מקרופאג PVs הוא קריטי עבור הבנה לישמניה התקפה אלימה3,4,5,6,7 ועבור פיתוח טיפולים חדשניים אפקטיבי.
נתאר כאן שיטה המשמשת באופן קבוע על ידי מעבדה שלנו ללמוד דלקת לישמניה ושכפול של מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs), אשר כוללת הערכה כמותית של מספר תאיים לישמניה לאורך זמן. התהליך כרוך קצירת ומונוציטים מ מח עצם העכבר ובידול מקרופאגים בתרבות, זיהום במבחנה עם צורות זיהומיות (metacyclic promastigotes או amastigotes) של לישמניה , כימות מספר תאיים טפילים-בכל פרק זמן של 24 שעות ביממה לתקופה של 72-96 שעות בעקבות זיהום. נעשה שימוש assay הזה במעבדה שלנו כדי לקבוע את ההשפעה של מספר גורמים סביבתיים, טפיל גנים, כולל זיהוי של תפקיד קריטי של ברזל בקידום התקפה אלימה ל' amazonensis היה עוד יותר לאימות על ידי לו טביעות רגל לימודי התפתחות הנגע עכברים6,8,9,10,11,12,13,14,15 . מאז כל המינים לישמניה פתוגניים לבסס את הנישה replicative שלהם בתוך המארח מקרופאגים, וזמינותו הזה יכול לשמש אוניברסלית האישושים התקפה אלימה על כל המינים לישמניה .
ביצוע BMM זיהומים מאפשר ניתוח אינטראקציות מארח-טפיל ברמה תא בודד, ובכך הבנה רחבה יותר של מה טפילים לישמניה לקיים אינטראקציה עם microenvironment מארח המועדפת שלהם, PVs של מקרופאגים. מקרופאג זיהום מבחני בהצלחה שנוצלו על ידי מספר קבוצות16,17,18,19,20,21,22 לחקור פונקציות הן מקרופאג מארח את גנים ספציפיים לישמניה , ואת מעורבותם פוטנציאליים הגומלין המורכבים המאפיינת את זיהום תאיים. זיהומים BMM לאפשר כימות של צמיחה טפיל כמו read-out ההשפעה של המארח גורמים המשפיעים על ההישרדות תאיים, כגון ייצור תחמוצת החנקן microbicidal, דור של מינים חמצן תגובתי, התנאים לוואי אחרים המערכת נתקלה בפנים PVs ליזוזום דמוי23. מקרופאג זיהום מבחני גם כבר מנוצל כדי לזהות הפניות סמים אנטי-leishmanial פוטנציאליים עבור פיתוח טיפולית13,24.
הטבע במבחנה של זיהומים BMM מספקת מספר יתרונות על פני שיטות אחרות כדי להעריך לישמניה התקפה אלימה. עם זאת, מספר מחקרים קודמים בחינת מנגנונים תאיים טפילים לשרוד לאורך זמן לא לכמת זיהום כמו בגודל21,20,קצב24. יתר על כן, מחקרים רבים התמקדו בעקבות זיהומים ויוו לאורך זמן עשו זאת על ידי מדידת גודל הנגע עורית וסימפטומים פיסיולוגיים אחרים הקשורים רק בעקיפין טפיל שכפול25,26 , 27. in vivo זיהום היא גישה מחמירה כדי להעריך את הטפיל התקפה אלימה, אבל מדידות גודל הנגע על סמך לו טביעות רגל ונפיחות לבדו לעיתים לקוי, כפי הם משקפים את התגובה דלקתיים ברקמות נגוע ולא המספר המוחלט של טפילים. מסיבה זו, התפתחות הנגע לו טביעות רגל מבחני חייבת להיות מלווה כימות של עומס הטפיל ברקמות נגוע, תהליך שדורש דילול המגביל ממושך מבחני28. בנוסף, מחקרים ויוו לעתים קרובות כרוך הקרבת בעלי חיים מרובים בנקודות שונות בזמן כדי לחלץ לרקמות של הריבית6,8,9,10, 11 , 13. לעומת זאת, ניתן להשיג מספר רב של BMMs חיה אחת, תאים אלה יכול להיות מצופה בתנאים לאפשר הערכה של זיהום בנקודות שונות בזמן. יתר על כן, בהשוואה ל ויוו מחקרים, ביצוע במבחנה BMM זיהומים מאפשר שליטה רבה יותר על תנאי הניסוי. לכימות של מקרופאגים להידבק יחד עם טפילים עצמם מאפשר שליטה מדויקת של הריבוי של זיהום (MOI) ושל תרבות תנאים. שליטה טובה על גורמים אלה יכולים להיות מפתח לזיהוי מאפייני דיסקרטית מסלולים סלולר, להבין את השפעתם על מהלך של זיהום.
לאור יתרונות אלו, זה די מפתיע כי מעט מאוד קבוצות לימוד לישמניה התקפה אלימה כה מנצלים מלא הערכה כמותית של שכפול תאיים ב מקרופאגים. במאמר זה נדון מלכודות נפוצות עשוי להיות פוגעות ניצול נרחב יותר של זה וזמינותו, ומספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להקל על ביצועה נאות. בהתחשב הדיוק שלה ואת צדדיות, וזמינותו זיהום BMM שנתאר כאן יכול לא רק להיות מנוצל כדי לחקור את האינטראקציות פתוגן-פונדקאי המשפיעים על התקפה אלימה לישמניה , אלא גם ללמוד אחרים המיקרואורגניזמים לשכפל בתוך מקרופאגים29. חשוב, זה וזמינותו יכולים גם להתפתח כשיטת הקרנת טרום קליניים מהיר וחסכוני עבור פיתוח תרופות אנטי-leishmanial.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

מחזור החיים של לישמניה, סוכן סיבתי של שושנת יריחו, נחליף בין שלבים promastigote, amastigote פנימה החרק ומארח חוליות, בהתאמה. בעוד תסמינים פתוגניים של שושנת יריחו, יכולה להשתנות מ שפיר נגעים עורית לטפסים מחלה קטלנית מאוד מהבטן תלוי בזן זיהומיות, כל המינים לישמניה שוכנים בתוך המקרופאגים מארח במהלך שלב חוליות מחזור החיים שלהם. לישמניה infectivity ולכן קשורה ישירות את יכולתו לפלוש, לשרוד, לשכפל בתוך וקואלות parasitophorous (PVs) בתוך המקרופאגים. לפיכך, הערכת היכולת של הטפיל לשכפל intracellularly מגישה כשיטה אמין לקביעת התקפה אלימה. לימוד פיתוח שושנת יריחו באמצעות מודלים בעלי חיים היא גוזלת זמן, מייגע, לעתים קרובות קשה, במיוחד עם הטפסים הקרביים pathogenically חשוב. נתאר כאן מתודולוגיה לעקוב אחר התפתחות תאיים לישמניה ב מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs). טפיל תאיים מספרים נקבעים במרווחי 24 שעות ביממה עבור h 72-96, בעקבות זיהום. שיטה זו מאפשרת נחישות אמין של ההשפעות של גורמים גנטיים שונים על לישמניה התקפה אלימה. לדוגמה, אנו מציגים כיצד אלל יחיד מחיקה של הגן לישמניה מיטוכונדריאלי ברזל טרנספורטר (LMIT1) וביכולתם של המתח מוטציה לישמניה amazonensis LMIT1/ΔLmit1 לגדול בתוך BMMs, המשקפים ירידה דרסטית התקפה אלימה לעומת פראי-סוג. Assay הזה גם מאפשר שליטה מדויקת על תנאי הניסוי, אשר ניתן לטפל בנפרד כדי לנתח את השפעת גורמים שונים (חומרים מזינים, מינים חמצן תגובתי, וכו '.) על האינטראקציה פתוגן-פונדקאי. לכן, ביצוע המתאימה ואת כימות של מחקרים זיהום BMM לספק חלופה לא פולשנית, מהיר, חסכוני, בטוחה ואמינה ללימודים במודל חיה קונבנציונלי.

לישמניה יש שתי צורות זיהומיות - promastigotes metacyclic, זאת להבדיל procyclic promastigotes בשלב נייח של התרבות, amastigotes, אשר נמצאים בשלבים תאיים (איור 1). במינים מסוימים לישמניה כגון ל' amazonensis, amastigotes גם ניתן להבחין בין תרבות axenic על ידי הסטת התאים promastigote להורדת pH (4.5) ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

כל המינים לישמניה פתוגניים שוכנים וישכפלו בתוך המקרופאגים של מארחיהם חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדביק מאתר מקרופאגים הנגזרות מח עצם בתרבות עם לישמניה, ואחריו כימות מדויק של קינטיקה גידול תאיים. שיטה זו שימושית עבור לימוד בודדים הגורמים המשפיעים על אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, לישמניה התקפה אלימה.

כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול&quot;ג בזמן

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...