Name: quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00
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이 작품은 노스 웨스트를 건강 그랜트 RO1 AI067979의 국가 학회에 의해 지원 되었다. YK 학부 친목에서 하 워드 휴즈 의학 연구소/대학 메릴랜드 칼리지 파크의 받는 사람입니다.

모든 실험 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 권장 사항에 따라 건강의 국가 학회에 의해 실시 했다 고 메릴랜드 대학 IACUC에 의해 승인 했다. 섹션 1-4에에서 설명 된 모든 단계 생물 층 류 캐비닛 안으로 밖으로 aseptically 실행 한다. 개인 보호를 사용 해야 합니다, 그리고 실험의 모든 단계에 걸쳐 라이브 Leishmania 기생충의 처리 하는 동안 주의 행사 한다.
1. ?...

위에서 설명한 BMM 감염 분석 결과 의해 생성 하는 양적 데이터 수 감염 속도 상대적으로 짧은 기간 (최대 2 주, 2에 비해 독성 속성에서 변경의 신뢰할 수 있는 결정을 조사 개월 vivo에서 실험에 필요한). 이 방법은 DNA 특정 염료 DAPI는 특히 대 식 세포 및 기생충 핵, 얼룩 및 신속한 식별 및 감염 된 세포의 정량화를 허용에 의존 합니다. 비교, Giemsa 같은 다른 얼룩 시각적 분석37</su...

Leishmaniasis는 protozoan 기생충 종의 속 Leishmania로 인 한 인간의 질병의 광범위 한 스펙트럼을 말합니다. 약 12만 명이 현재 감염 된 Leishmania 전세계, 그리고 350만 이상의 위험이 있습니다. 질병 병리학 Leishmania 종에 고 호스트 요인에 따라 그리고 증상 무해 한 자기 치유 피부 병 변에서 치명적인 visceralizing 형태 다. 최악의 인간 질병으로 말라리아 후 순위 protozoan 기생충1감염에의 한 치료, 내장 leishmaniasis 치명적인 경우. 질병 병 리와 증상에 광범위 한 차이도 불구 하 고 모든 Leishmania 종 digenic 수명-주기 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트를 각각 교대로 있다. 내부 척추 동물, Leishmania 침공에 대 한 호스트 세포를 대상 하 고 parasitophorous 그들 (PVs), 높은 악성의 amastigote 형태의 복제 속성 phagolysosomes의 산 성 구획의 형성을 유발. Amastigotes 만성 감염 시 호스트 조직에서 유지 하 고 전달 될 수 있는 감염 되지 않은 앞으로 sandflies, 전송 주기를 완료. 따라서, 인간의 질병 개발의 맥락에서 amastigotes는 가장 중요 한 Leishmania 생명주 기 양식2. Amastigotes 대 식 세포 증후군 내부 복제 하는 방법을 조사 하는 것이 중요 이해 Leishmania 독성3,,45,,67 와 새로운 효능 요법의 개발입니다.
여기 정기적으로 Leishmania 감염 및 시간이 지남에 세포내 Leishmania 수의 양적 평가 포함 하는 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 복제 연구를 우리의 실험실에 의해 사용 되는 방법을 설명 합니다. 과정 포함 Leishmania 그리고 부 량의 문화에서 대 식 세포, 생체 외에서 감염 감염 형태 (metacyclic promastigotes 또는 amastigotes)와 마우스 골 수에서 분화 monocytes의 수확은 세포내 기생충 감염 다음 72 96 h의 기간에 대 한 모든 24 시간 간격의 수입니다. 이 분석 결과 여러 환경 요인 및 기생충의 유전자, 노상 강도 의해 더 확인 되었다 L. amazonensis 독성을 홍보에 철의 중요 한 역할의 식별을 포함 하 여 영향을 확인 하기 위해 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. 마우스6,,89,10,11,12,13,14,15 병 변 개발 연구 . 때문에 모든 병원 성 Leishmania 종 설정할 호스트 세포 안에 그들의 일차 틈새,이 분석 결과 모든 Leishmania 종에서 독성 결정에 대 한 보편적으로 사용할 수 있습니다.
BMM 감염 수행 단일 세포 수준에서 호스트-기생충 상호 작용의 분석 및 따라서 Leishmania 기생충 그들의 기본 설정된 호스트 microenvironment, 대 식 세포의 PVs 상호 작용 하는 방법에 대 한 더 광범위 한 이해를 수 있습니다. 대 식 세포 감염 분석 실험 성공적으로 사용 되었습니다 여러 그룹16,17,18,19,20,,2122 탐험 호스트 macrophage Leishmania 특정 유전자와 세포내 감염 특징 복잡 한 상호 작용에 있는 그들의 잠재적인 관련 기능. BMM 감염 microbicidal 산화 질소 생산, 반응성 산소 종의 생성 및 다른 조건 같은 세포내 생존에 영향을 주는 호스트 요인의 영향에의 한 읽기로 기생충 성장의 정량화를 허용 리소좀-같은 PVs23내부 발생 했습니다. 대 식 세포 감염 분석 치료 개발13,24에 대 한 잠재적인 안티 leishmanial 마약 단서를 식별 하도 이용 되어 있다.
BMM 감염의 생체 외에서 특성 Leishmania 독성을 평가 하기 위해 다른 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 그러나, 시간이 지남에 세포내 기생충 생존의 메커니즘을 검토 하는 여러 이전의 연구 속도20,,2124로 감염을 계량 하지 않았다. 또한, 시간이 지남에 vivo에서 감염 다음에 초점을 맞춘 많은 연구 그렇게 피부 병 변의 크기와 직접 관련 없는 기생충 복제25,26 다른 생리 적인 증상을 측정 하 여 , 27. vivo에서 감염 기생충 독성 평가에 대 한 엄격한 접근 이지만 혼자 붓기 노상 강도에 따라 병 변 크기 측정은 종종 적절 한, 그들은 감염 된 조직에서 염증 반응을 반영 하지는 기생충의 절대 수입니다. 따라서, 노상 강도 병 변 개발 분석 뒤에 감염 된 조직, 기생충 부하의 정량화 해야 긴 제한 희석을 요구 하는 절차는28분석 실험. 또한, vivo에서 연구는 종종 포함 관심6,,89,10, 의 조직 추출 하는 시간에 서로 다른 지점에서 여러 동물을 희생 11 , 13. 대조적으로, BMMs의 다 수는 단지 하나의 동물에서 얻어질 수 있다 고이 세포는 다양 한 지점에서 시간에 감염의 평가 허용 하는 조건에서 도금 될 수 있다. 또한, vivo에서 연구에 비해, 실험 조건 제어가 있습니다 BMM 감염 체 외에서 수행. 스스로 기생충 함께 감염 되는 세포를 측정 복합성 감염 (MOI)의 문화 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 이러한 요소를 세밀 하 게 제어 키 이산 세포질 통로의 특성을 식별 하 고 감염의 과정에 미치는 영향을 이해 하실 수 있습니다.
이러한 이점을 감안할 때, 그것은 다소 놀라운 Leishmania 독성을 공부 하는 아주 몇몇 그룹 세포에서 세포내 복제의 양적 평가의 활용을 찍은 지금까지 있다. 이 문서에서는, 우리는이 분석 결과의 더 광범위 한 이용을 저해 하 고 적절 한 구현을 촉진 하기 위하여 단계별 프로토콜을 제공 수 있습니다 일반적인 함정 토론. 정밀도 및 다양성을 고려 하면 우리가 여기 설명 BMM 감염 분석 결과 하지만 이용 될 수 있다 탐험 Leishmania 독성에 영향을 미치는 호스트 병원 체 상호 작용 뿐만 아니라 내부 복제 하는 다른 미생물을 공부 하 대 식 세포29 중요 한 것은,이 분석 결과 또한 안티-leishmanial 약물 개발에 대 한 신속 하 고 경제적인 전 임상 스크리닝 방법으로 개발할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

Leishmania, leishmaniasis의 원인이 되는 에이전트의 수명 주기는 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트 간에 각각 대체 항목입니다. 모든 Leishmania 종의 척 추가 있는 단계 호스트 세포 안에 있는 leishmaniasis의 병원 성 증상이 널리, infective 수 종에 따라 매우 치명적인 내장 질병 형태에 양성 피부 병 변에서 다를 수 있습니다. 그들의 수명 주기입니다. Leishmania infectivity은 따라서 직접 관련이 침공, 생존과 parasitophorous 그들 (PVs) 대 식 세포 내에서 복제 하는 기능. 따라서, 독성을 결정 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 제공 침 복제 하는 기생충의 능력을 평가 합니다. Leishmaniasis 개발 동물 모델을 사용 하 여 공부 하는 것은, 지루한 자주 하기가 어렵고, 특히 pathogenically 중요 한 내장 형태 와입니다. 여기 골 수 유래 세포 (BMMs)에 세포내 Leishmania 개발을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 세포내 기생충 숫자 72 96 h 다음 감염에 대 한 24 시간 간격에 따라 결정 됩니다. 이 메서드는 Leishmania 독성에 다양 한 유전적 요인의 영향의 신뢰할 수 있는 결정에 대 한 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 어떻게 Leishmania 미토 콘 드리 아 철 운송업 자 유전자 (LMIT1)의 단일 대립 유전자 삭제 손상 수 Leishmania amazonensis 돌연변이 스트레인 LMIT1/ΔLmit1 의 BMMs, 내부 성장 보여 야생-타입에 비해 독성에서의 급격 한 감소를 반영 합니다. 이 분석 결과 또한 호스트 병원 체 상호 작용에 다양 한 요인 (영양소, 반응성 산소 종 등)의 영향을 분석을 개별적으로 조작할 수 있습니다 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 따라서, 적절 한 실행 및 BMM 감염 연구의 정량화 기존의 동물 모델 연구에 대 한 비-침략 적, 급속 한, 경제, 안전 하 고 안정적인 대안을 제공합니다.

Leishmania 는 두 감염 양식-문화, 고정 단계에서 procyclic promastigotes에서 차별화 하는 metacyclic promastigotes 및 amastigotes, 세포내 단계 (그림 1). L. amazonensis같은 일부 Leishmania 종, amastigotes 또한 분화 될 수 있다 axenic 문화에 낮은 pH (4.5)과 온도 (32 ° C) 조건 BMM PVs 안에서 발견 된 것과 유사한 promastigote 셀을 이동 하 여 8 ...

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Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

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Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

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식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...