Name: quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant RO1 AI067979 til NWA. Novotel er mottaker av undervisning fellesskap fra Howard Hughes Medical Institute/Universitetet i Maryland College Park.

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med anbefalingene i Guide og bruk av forsøksdyr ved National Institutes of Health og ble godkjent av universitetet i Maryland IACUC. Alle trinnene som er beskrevet i avsnitt 1 til 4 skal utføres tas aseptisk inne biologiske laminær strømning skap. Personlig verneutstyr benyttes, og forsiktighet bør utvises i håndtering av live Leishmania parasitter gjennom alle faser av eksperimentering.
1. isolering og differensiering av Ben m...

Kvantitative data produsert av BMM infeksjon analysen beskrevet ovenfor, gjør etterforskere utbredelsen av smitte og pålitelig beslutning av endringer i virulens egenskaper i en relativt kortere tidsperiode (maksimalt 2 uker, sammenlignet med 2 måneder kreves for i vivo eksperimenter). Denne metoden er avhengig av DNA bestemt fargestoff DAPI, som spesielt flekker macrophage og parasitt kjerner, og tillater rask identifikasjon og måling av infiserte celler. Sammenligning binde andre flekker som Giemsa til et ...

Leishmaniasis refererer til et bredt spekter av menneskelige sykdommer forårsaket av protozoan parasitten arter av slekten Leishmania. Ca 12 millioner mennesker er nå infisert med Leishmania over hele verden mer enn 350 millioner er utsatt. Sykdom patologi avhenger av den Leishmania arten og vert faktorer og symptomene varierer fra ufarlige selvhelbredende hudlesjoner dødelige visceralizing former. Hvis ubehandlet, visceral leishmaniasis er kritisk, rangering etter malaria som dødeligste menneskelig sykdom forårsaket av infeksjon med en protozoan parasitten1. Til tross for omfattende forskjellene i sykdom patologi og symptomer har alle Leishmania arter en digenic livssyklus alternerende mellom promastigote og amastigote stadier i insekt og virveldyr verter, henholdsvis. Innsiden virveldyr, Leishmania målet vert makrofager for invasjonen og indusere dannelsen av parasitophorous vacuoles (PV), surt deler med egenskapene til phagolysosomes der skjemaene svært virulente amastigote gjenskape. Amastigotes vedvarer i vert vev under kroniske infeksjoner og kan sendes frem til uninfected sandflies, fullføre overføring syklusen. Derfor, i sammenheng med menneskelig sykdom utvikling, amastigotes er den viktigste Leishmania livssyklus skjema2. Undersøker hvordan amastigotes gjenskape inne macrophage PVs er avgjørende for å forstå Leishmania virulens3,4,5,6,7 og for den utviklingen av romanen effektiv terapi.
Her beskriver vi en metode jevnlig brukt av vårt laboratorium Leishmania infeksjon og replikasjon i bein margtransplantasjon-avledet makrofager (BMMs), som involverer kvantitativ vurdering av antall intracellulær Leishmania over tid. Prosessen innebærer høsting av monocytter fra musen benmargen og differensiering makrofager i kultur, i vitro infeksjon med infeksiøs skjemaer (metacyclic promastigotes eller amastigotes) av Leishmania og måling av den antall intracellulære parasitter på 24-timers intervall for en periode på 72-96 timer etter infeksjon. Denne analysen er brukt i vårt laboratorium for å fastslå effekten av flere miljøfaktorer og parasitten gener, inkludert identifisering av kritiske rollen av jern i å fremme L. amazonensis virulens som ble ytterligere validert av footpad lesjonen development studier i mus6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Siden alle sykdomsfremkallende Leishmania arter etablere sin replicative nisje inne vert makrofager, kan denne analysen brukes universelt for virulens avgjørelser i alle Leishmania arter.
Utføre BMM infeksjoner kan analyse av vert-parasitten samhandlinger på enkeltcelle nivå, og dermed en mer omfattende forståelse av hvordan Leishmania parasitter samhandler med sine foretrukne vert microenvironment, PVs av makrofager. Macrophage infeksjon analyser har blitt brukt av flere grupper16,17,18,19,20,21,22 å utforske funksjonene i både vert macrophage og Leishmania bestemte gener og deres potensielle engasjement i det komplekse samspillet som karakteriserer intracellulær infeksjon. BMM infeksjoner tillate kvantifisering av parasitten vekst som en skrivebeskyttet ut av virkningen av vert faktorer som påvirker intracellulær overlevelse, som microbicidal nitrogenoksid produksjonen, generasjon av frie radikaler og andre ugunstige forhold oppdaget i lysosome-lignende PVs23. Macrophage infeksjon analyser har også blitt benyttet for å identifisere potensielle anti-leishmanial narkotika leder for terapeutisk utvikling13,24.
Natur i vitro BMM infeksjoner gir flere fordeler sammenlignet med andre metoder for å vurdere Leishmania virulens. Imidlertid flere tidligere studier som har undersøkt virkningsmekanismer intracellulær parasitten overlevelse over tid ikke tallfeste infeksjon som en pris20,21,24. Dessuten, mange studier fokuserte på følgende i vivo infeksjoner over tid gjorde det ved å måle kutan lesjon størrelse og andre fysiologiske symptomer som gjelder bare indirekte parasitten replikering25,26 , 27. i vivo infeksjon er en strenge tilnærming til vurdere parasitten virulens, men lesjon størrelse målinger basert på footpad hevelse alene er ofte utilstrekkelig, som gjenspeiler de inflammatorisk respons i infiserte vev og ikke den absolutte antallet parasitter. Derfor footpad lesjon utvikling analyser må etterfølges av kvantifisering av parasitten lasten i infiserte vev, søk en prosedyre som krever lange begrensende fortynning28. I tillegg innebære i vivo studier ofte at flere dyr på ulike tidspunkter i tid for å pakke ut vev av interesse6,8,9,10, 11 , 13. derimot store antall BMMs kan fås fra ett dyr, og disse cellene kan være belagt under forhold som tillater vurdering av infeksjon på ulike punkter i tid. Videre gir sammenlignet med i vivo studier, utfører i vitro BMM infeksjoner større kontroll over eksperimentelle forhold. Kvantifisere makrofager er infisert med parasitter selv tillater presis kontroll over mangfoldet av infeksjon (MOI) og kultur forhold. Bedre kontroll over disse faktorene kan være nøkkelen identifiserende kjennetegn av diskrete mobilnettet og forstå deres innvirkning på løpet av infeksjon.
Gitt disse fordelene, er det noe overraskende at få grupper studere Leishmania virulens hittil har tatt full nytte av kvantitativ vurdering av intracellulær replikering i makrofager. I denne artikkelen diskutere vi felles fallgruver som kan være hindrer den mer omfattende utnyttelsen av denne analysen, og gi en trinnvis protokoll for å gjøre gjennomføringen riktig. Vurderer sin presisjon og allsidighet, BMM infeksjon analysen beskriver vi her kan ikke bare benyttes å utforske vert-patogen interaksjoner påvirker Leishmania virulens, men også å studere andre mikroorganismer som gjenskaper inne makrofager29. Viktigere, kan denne analysen også bli utviklet som en rask og økonomisk pre-klinisk screening metode for anti-leishmanial narkotika utvikling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

Livssyklusen til Leishmania, den utløsende agenten for leishmaniasis, veksler mellom promastigote og amastigote stadier i insekt og virveldyr verter, henholdsvis. Mens patogene symptomer på leishmaniasis kan variere mye, fra godartet kutan lesjoner til svært dødelig visceral sykdom former avhengig av infeksiøs arter, bor alle Leishmania arter inne vert makrofager under virveldyr Stadium i livssyklusen. Leishmania infectivity er derfor direkte knyttet til sin evne til å invadere overleve og gjenskape innen parasitophorous vacuoles (PV) i makrofager. Derfor fungerer vurdere parasittens evne til å reprodusere intracellulært som en pålitelig metode for å bestemme virulens. Studere leishmaniasis utvikling med dyremodeller er tidkrevende, kjedelig og ofte vanskelig, spesielt med pathogenically viktig visceral skjemaer. Her beskriver vi en metodikk følge intracellulær utviklingen av Leishmania i Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMMs). Intracellulær parasitten tall bestemmes i 24-timers intervaller på 72-96 h etter infeksjon. Denne metoden gir et pålitelig fastsettelse av virkningene av ulike genetiske faktorer på Leishmania virulens. Som et eksempel viser vi hvordan en enkelt allelet sletting av Leishmania mitokondrie jern Transporter genet (LMIT1) svekker evnen til Leishmania amazonensis mutert stamme LMIT1/ΔLmit1 å vokse i BMMs, reflekterer en drastisk reduksjon i virulens sammenlignet med vill-type. Denne analysen kan også nøyaktig kontroll over eksperimentelle forhold, som kan redigeres individuelt analysere påvirkning av ulike faktorer (næringsstoffer, reaktive oksygen arter, osv.) på verten-patogen samhandlingen. Derfor gir riktig gjennomføring og kvantifisering BMM infeksjon studiene en ikke-invasiv, rask, økonomisk, sikker og pålitelig alternativ til konvensjonelle dyremodell studier.

Leishmania har to infeksiøs former - metacyclic promastigotes som skiller fra procyclic promastigotes på den stasjonære fasen av kultur og amastigotes, som er de intracellulære stadiene (figur 1). I enkelte Leishmania arter som L. amazonensis, kan amastigotes også differensieres i axenic kultur av skiftende promastigote cellene for å senke pH (4.5) og høy temperatur (32 ° C), forhold som ligner de i BMM PVs <sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Alle sykdomsfremkallende Leishmania arter ligge og gjenskape i makrofager av deres virveldyr verter. Her presenterer vi en protokoll for å infisere murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager i kultur med Leishmania, etterfulgt av presise kvantifisering av intracellulær vekst kinetics. Denne metoden er nyttig for studerer individuelle faktorer som påvirker vert-patogen samhandling og Leishmania virulens.

Kvantifisering av intracellulær vekst i makrofager er en rask og pålitelig metode for å vurdere virulens av Leishmania parasitter

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening mot intracellulære<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Menneskelig Akutt monocyttisk leukemi cellelinje

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analyse for kvantifisering av intracellulær mykobakterier tilpasset høygjennomstrømning / screening av høyt innhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: High-throughput Kvantifisering av Colony Vekst og oppholdstid

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere Anti-sopp aktivitet av isolerte alveolære makrofager ved konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Påføre en induserbar Expression System for å studere forstyrrelser av bakteriell virulensfaktorer med intracellulære signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikasjon av virulens markører av Mycobacterium abscessus for intracellulær replikering i Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...