Name: quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subsídio de saúde RO1 AI067979 a NWA. YK é destinatário de graduação comunhão de Howard Hughes Medical Institute/Universidade de Maryland College Park.

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos em conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório por institutos nacionais de saúde e foram aprovados pela Universidade de Maryland IACUC. Todos os passos descritos nas seções 1 a 4 devem ser efectuados em condições assépticas dentro dos armários biológica de fluxo laminar. Proteção pessoal deve ser usada, e o cuidado deve ser exercitado durante a manipulação de parasitas de Leishmania ao vivo durante...

Os dados quantitativos produzidos por BMM infecção ensaio descrito acima, permite que os investigadores obter taxas de infecção e uma determinação confiável das mudanças nas propriedades de virulência em um período de tempo relativamente curto (máximos 2 semanas, em comparação com os 2 meses exigidos para experimentos em vivo ). Esse método depende o corante específico DNA DAPI, que especificamente manchas núcleos macrófago e parasita e permite a rápida identificação e quantificação de cél...

Leishmaniose refere-se a um amplo espectro de doenças humanas causadas por espécies de parasitas protozoários do gênero Leishmania. Atualmente, cerca de 12 milhões de pessoas estão infectados com Leishmania em todo o mundo, e mais de 350 milhões estão em risco. A patologia da doença depende da espécie de Leishmania e fatores do hospedeiro, e sintomas variam de lesões de pele de auto-recuperação inócuo para formas visceralizing letais. Se leishmaniose visceral, não tratada é fatal, classificação somente depois da malária, como a doença mais mortal humana causada pela infecção por um protozoário parasita1. Apesar das diferenças amplas na patologia da doença e sintomas, todas as espécies de Leishmania têm um digenic-ciclo de vida alternando entre fases amazonensis e amastigotas no interior do inseto e hospedeiros vertebrados, respectivamente. Dentro vertebrados, Leishmania alvo macrófagos do hospedeiro para invasão e induzem a formação de vacúolos parasitophorous (PVs), compartimentos ácidos com propriedades de fagolisossomas onde replicam as formas amastigotas altamente virulento. Amastigotes persistir nos tecidos do hospedeiro durante infecções crônicas e podem ser passados para a frente não infectados flebotomíneos, completando o ciclo de transmissão. Portanto, no contexto do desenvolvimento de doenças humanas, amastigotes são o mais importante de formulário do ciclo de vida Leishmania 2. Investigar como amastigotes replicar dentro macrófago PVs é fundamental para a compreensão de Leishmania virulência3,4,5,6,7 e para o desenvolvimento de novas terapias eficazes.
Descrevemos aqui um método usado regularmente por nosso laboratório para estudar a infecção de Leishmania e replicação em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs), que envolve a avaliação quantitativa do número de intracelular Leishmania ao longo do tempo. O processo envolve a colheita de monócitos da medula óssea de rato e diferenciação de macrófagos na cultura, na vitro infecção com formas infectantes (promastigotas metacyclic ou amastigotes) de Leishmania e quantificação do número de parasitas intracelulares em cada intervalo de 24 h, por um período de 72-96 h após a infecção. Este ensaio tem sido usado em nosso laboratório, para determinar o impacto de diversos fatores ambientais e os genes do parasita, incluindo a identificação do papel crítico de ferro na promoção têm L. virulência que mais foi validada por Whitney estudos de desenvolvimento de lesão em ratos6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Desde que todas as espécies de Leishmania patogênicas estabelecer seu nicho replicative dentro de macrófagos do hospedeiro, este ensaio pode ser usado universalmente para determinações de virulência em todas as espécies de Leishmania .
Realizar infecções BMM permite a análise das interações hospedeiro-parasita no nível da célula única e, portanto, uma compreensão mais ampla de como parasitas Leishmania interagem com seu microambiente hospedeiro preferencial, os PVs dos macrófagos. Ensaios de infecção de macrófagos têm sido utilizados com sucesso por vários grupos de16,17,18,19,20,21,22 para explorar funções dos macrófagos do hospedeiro e Leishmania genes específicos e sua potencial participação em complexa interação que caracteriza a infecção intracelular. Infecções de BMM permitem a quantificação do crescimento do parasita como uma leitura do impacto dos fatores do hospedeiro que influenciam a sobrevivência intracelular, tais como a produção de óxido nítrico de microbicidas, geração de espécies reativas de oxigênio e outras condições adversas encontrado no interior do lisossomo, como PVs23. Ensaios de infecção de macrófagos também têm sido utilizados para identificar pistas de drogas antileishmaniótica potencial para o desenvolvimento de terapêuticas13,24.
A natureza em vitro de infecções BMM fornece várias vantagens sobre outros métodos para avaliar a virulência de Leishmania . No entanto, vários estudos anteriores examinar mecanismos de sobrevivência do parasita intracelular ao longo do tempo não quantificar a infecção como uma taxa20,21,24. Além disso, muitos estudos focados nos seguintes infecções na vivo ao longo do tempo fizeram medindo o tamanho da lesão cutânea e outras sintomas fisiológicos apenas indiretamente relacionados ao parasita replicação25,26 , 27. infecção in vivo é uma abordagem rigorosa para avaliar a virulência do parasita, mas medições de tamanho de lesão baseadas no Whitney inchaço sozinho são muitas vezes inadequadas, como eles refletem a resposta inflamatória nos tecidos infectados e não o número absoluto de parasitas. Por esta razão, o desenvolvimento de lesão de Whitney ensaios têm de ser seguidos pela quantificação da carga parasita em tecidos infectados, um procedimento que requer diluição limitante longa ensaios28. Além disso, estudos em vivo muitas vezes envolvem sacrificar vários animais em pontos diferentes na hora de extrair os tecidos de interesse6,8,9,10, 11 , 13. em contraste, um grande número de BMMs pode ser obtido de um animal, e estas células podem ser revestidas em condições que permitam a avaliação de infecção em vários pontos no tempo. Além disso, comparado com estudos em vivo , realizando em vitro infecções BMM permite maior controle sobre as condições experimentais. Quantificar os macrófagos para ser contagiado como os parasitas se permite um controle preciso da multiplicidade de infecção (MOI) e das condições de cultura. Bom controle sobre esses fatores pode ser chave na identificação de características de vias celulares discretas e na compreensão do seu impacto sobre o curso da infecção.
Dadas essas vantagens, é um pouco surpreendente que muito poucos grupos estudando a virulência de Leishmania até agora tomaram vantagem cheia de avaliação quantitativa de replicação intracelular em macrófagos. Neste artigo, discutimos as armadilhas comuns que podem estar prejudicando a utilização mais ampla deste teste e fornecer um protocolo passo a passo para facilitar a sua correcta aplicação. Considerando sua precisão e versatilidade, o ensaio de infecção BMM que descrevemos aqui pode não apenas ser utilizado para explorar interações patógeno-hospedeiro, influenciando a virulência de Leishmania , mas também para estudar outros microorganismos que replicam dentro os macrófagos29. Importante, este ensaio também pode ser desenvolvido como um método de triagem pré-clínica rápida e econômica para o desenvolvimento de drogas antileishmaniótica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

O ciclo de vida de Leishmania, o agente causador da leishmaniose, alterna-se entre as fases amazonensis e amastigotas no interior do inseto e hospedeiros vertebrados, respectivamente. Enquanto patogénicos sintomas da leishmaniose podem variar amplamente, de lesões cutâneas benignas para formas altamente fatal doença visceral, dependendo da espécie infecciosa, todas as espécies de Leishmania residem no interior de macrófagos do hospedeiro durante a fase de vertebrados de seu ciclo de vida. Infectividade de Leishmania , portanto, está diretamente relacionada à sua capacidade de invadir, sobreviver e replicar dentro parasitophorous vacúolos (PVs) dentro de macrófagos. Assim, avaliar a capacidade do parasita para replicar intracelular serve como um método confiável para determinar a virulência. Estudar o desenvolvimento de leishmaniose usando modelos animais é demorado, fastidioso e muitas vezes difícil, especialmente com as formas viscerais pathogenically importantes. Aqui descrevemos uma metodologia para acompanhar o desenvolvimento intracelular de Leishmania na medula óssea-derivada de macrófagos (BMMs). Parasita intracelular números são determinados em intervalos de 24 h para 72-96 h após a infecção. Este método permite uma determinação confiável dos efeitos de diferentes fatores genéticos na virulência de Leishmania . Como exemplo, mostramos como uma exclusão de único alelo do gene transportador de ferro mitocondrial Leishmania (LMIT1) prejudica a capacidade da estirpe mutante de Leishmania têm LMIT1/ΔLmit1 para crescer dentro BMMs, refletindo uma redução drástica na virulência em relação ao tipo selvagem. Este ensaio também permite um controle preciso das condições experimentais, que podem ser manipulados individualmente para analisar a influência de vários fatores (nutrientes, espécies reativas de oxigênio, etc.) sobre a interação patógeno-hospedeiro. Portanto, a execução adequada e quantificação dos estudos de infecção BMM fornecem uma alternativa não-invasiva, rápida, econômica, segura e confiável para estudos de modelo animal convencional.

Leishmania tem duas formas infectantes - metacyclic promastigotas que diferenciam de promastigotas procyclic na fase estacionária da cultura e amastigotes, quais são os estágios intracelulares (Figura 1). Em algumas espécies de Leishmania , tais como L. têm, amastigotes também podem ser diferenciados na cultura axénica deslocando as células amazonensis para abaixar o pH (4.5) e temperatura elevada (32 ° C), condições simi...

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Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Todas as espécies de Leishmania patogênicas residem e replicam no interior de macrófagos de seus hospedeiros vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para infectar murino macrófagos derivados da medula óssea em cultura com Leishmania, seguido por quantificação exacta da cinética de crescimento intracelular. Esse método é útil para estudar os fatores individuais que influenciam a interação patógeno-hospedeiro e virulência de Leishmania .

Quantificação de crescimento intracelular dentro de macrófagos é um rápido e confiável método para avaliar a virulência de Leishmania parasitas

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

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