Name: quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Detta arbete stöds av National Institutes of Health grant RO1 AI067979 till NWA. YK är mottagaren av grundutbildning fellowship från Howard Hughes Medical Institute/universitetet i Maryland College Park.

Alla experimentella rutiner genomfördes i enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur av National Institutes of Health och godkändes av University of Maryland's IACUC. Alla steg som beskrivs i avsnitt 1 till 4 bör utföras aseptiskt inuti biologiska laminär skåp. Personligt skydd bör användas, och försiktighet bör iakttas vid hantering av levande Leishmania parasiter genom alla skeden av experimenterande.
1. isolering och differentie...

Kvantitativa data produceras av BMM infektion analysen beskrivs ovan, kan utredarna att få priser för infektion och en tillförlitlig bestämning av förändringar i virulens boenden i relativt kortare period (högst 2 veckor, jämfört med 2 månader som krävs för i vivo experiment). Denna metod förlitar sig på DNA specifika färgämnet DAPI, som specifikt fläckar makrofag och parasit kärnor, och tillåter snabb identifiering och kvantifiering av infekterade celler. I jämförelse binder andra fläckar ...

Leishmaniasis refererar till ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar orsakade av protozo parasitarter av släktet Leishmania. Cirka 12 miljoner människor är för närvarande infekterade med Leishmania världen över, och mer än 350 miljoner är i riskzonen. Sjukdom patologi beror på arterna som Leishmania och värd faktorer och symtom varierar från innocuous självläkande hudlesioner dödliga visceralizing former. Om obehandlat, visceral leishmaniasis är dödlig, förmånsrätt endast efter malaria som den dödligaste mänskliga sjukdomen orsakas av infektion med en protozo parasit1. Trots omfattande skillnaderna i sjukdom patologi och symtom har alla Leishmania arter en digenic livscykel alternerande mellan promastigote och amastigote stadier inuti insekter och ryggradsdjur värdar, respektive. Insidan ryggradsdjur, Leishmania target host makrofager för invasion och inducera bildandet av parasitophorous vakuoler (PVs), sura fack med egenskaperna hos phagolysosomes där de mycket virulent amastigote formerna replikera. Amastigotes kvarstår i värd vävnader under kroniska infektioner och kan föras framåt till oinfekterade sandflugor, slutföra överföringen cykeln. Därför, i samband med mänsklig sjukdomsutveckling, amastigotes är den viktigaste Leishmania lifecycle form2. Undersöka hur amastigotes replikera inuti makrofag PVs är kritisk för förståelse Leishmania virulens3,4,5,6,7 och för den utvecklingen av nya effektiva behandlingar.
Här beskriver vi en metod som används regelbundet av vårt laboratorium för att studera Leishmania -infektion och replikering i benmärgen-derived makrofager (BMMs), som innebär kvantitativ bedömning av numrera av intracellulära Leishmania över tid. Processen omfattar skörd av monocyter från mus benmärg och differentiering till makrofager i kultur, in vitro- infektion med infektiös former (metacyclic promastigotes eller amastigotes) av Leishmania och kvantifiering av de antal intracellulära parasiter på varje 24 h intervall under en 72-96 timmar efter infektion. Denna analys har använts i vårt laboratorium för att avgöra inverkan av flera miljöfaktorer och parasit gener, inklusive identifiering av järn kritiska roll att främja L. amazonensis virulens som ytterligare godkänts av footpad lesion utvecklingsstudier möss6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Eftersom alla patogena Leishmania arter etablera sin replikationsförmåga nisch inne värd makrofager, kan denna analys användas universellt för virulens bestämningar i alla Leishmania arter.
Utför BMM infektioner möjliggör analys av värd-parasit interaktioner på enstaka cellnivå, och därmed en mer omfattande förståelse för hur Leishmania parasiter interagerar med deras föredragna värden mikromiljö, PVs av makrofager. Makrofag infektion analyser har använts framgångsrikt av flera grupper16,17,18,19,20,21,22 att utforska funktioner i både värd makrofag Leishmania specifika gener och deras potentiella deltagande i det komplexa samspelet som kännetecknar intracellulära infektion. BMM infektioner möjliggöra kvantifiering av parasiten tillväxt som en avläsning av värd faktorer som påverka intracellulär överlevnad, såsom microbicidal kväveoxid produktion, generation av reaktiva syreradikaler och andra ogynnsamma effekter påträffade inuti den Lysosomen-liknande PVs23. Makrofag infektion analyser har också använts för att identifiera potentiella anti-leishmanial drug leads för terapeutisk utveckling13,24.
In vitro- beskaffenhet BMM infektioner ger flera fördelar jämfört med andra metoder för att bedöma Leishmania virulens. Flera tidigare studier att undersöka mekanismer för intracellulär parasit överlevnad över tid dock inte kvantifiera infektion som en kurs20,21,24. Dessutom gjorde många studier fokuserat på följande i vivo infektioner med tiden så genom att mäta kutan lesionsstorlek och andra fysiologiska symtom som endast indirekt avser parasit replikering25,26 , 27. in vivo -infektion är en stränga metod att bedöma parasit virulens, men lesionens storlek mätningar baserat på footpad svullnad ensam är ofta otillräckliga, eftersom de återspeglar den inflammatoriska reaktionen i infekterade vävnader och inte den absoluta antalet parasiter. Av denna anledning, footpad lesion utveckling analyser måste följas av kvantifiering av parasiten lasten i infekterade vävnader, analyser en procedur som kräver långa begränsande utspädning28. Dessutom, innebär in-vivo studier ofta att offra flera djur vid olika punkter i tiden för att extrahera vävnader av intresse6,8,9,10, 11 , 13. däremot stort antal BMMs kan erhållas från bara ett djur, och dessa celler kan beläggas under förhållanden som gör bedömningen av infektion på olika punkter i tiden. Dessutom tillåter utför in vitro- BMM infektioner jämfört med in-vivo studier, större kontroll över försöksbetingelser. Kvantifiera den makrofager att smittas tillsammans med parasiterna själva tillåter exakt kontroll av multiplicityen av infektion (MOI) och odlingsbetingelser. Fina kontroll över dessa faktorer kan vara avgörande att identifiera kännetecken för diskreta cellulära vägar och förstå deras inverkan på loppet av infektion.
Med tanke på dessa fördelar, är det något förvånande att mycket få grupper studerar Leishmania virulens hittills har tagit full nytta av kvantitativ bedömning av intracellulär replikering i makrofager. I den här artikeln diskuterar vi vanliga fallgropar som kan vara hämmar mer omfattande utnyttjande av denna analys, och tillhandahålla ett stegvisa protokoll för att underlätta genomförs korrekt. Med tanke på dess precision och mångsidighet, BMM infektion analysen beskriver vi här kan inte bara utnyttjas att utforska värd-patogen interaktioner påverkar Leishmania virulens, men också att studera andra mikroorganismer som replikerar inuti makrofager29. Viktigast av allt, kan denna analys också utvecklas som en snabb och ekonomisk prekliniska screeningmetod för anti-leishmanial läkemedelsutveckling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

Livscykeln för Leishmania, vilka smittämnen av leishmaniasis, växlar mellan promastigote och amastigote stadier inuti insekten och ryggradsdjur värdar, respektive. Medan patogena symtom av leishmaniasis kan variera kraftigt, från godartade kutana lesioner mycket dödlig visceral sjukdom former beroende på de smittbärande arterna, finnas alla Leishmania arter inuti värd makrofager under ryggradsdjur deras livscykel. Leishmania smittsamhet är därför direkt relaterad till dess förmåga att invadera, överleva och replikera inom parasitophorous vakuoler (PVs) inuti makrofager. Således fungerar att bedöma parasitens möjlighet att replikera intracellulärt som en pålitlig metod för att bestämma virulens. Att studera leishmaniasis utveckling med hjälp av djurmodeller är tidskrävande, tråkiga och ofta svårt, särskilt med pathogenically viktigt viscerala former. Här beskriver vi en metod för att följa intracellulära utvecklingen av Leishmania i benmärgen-derived makrofager (BMMs). Intracellulär parasit nummer bestäms vid 24 h intervall för 72-96 timmar efter infektion. Denna metod möjliggör en tillförlitlig bestämning av effekterna av olika genetiska faktorer på Leishmania virulens. Som ett exempel visar vi hur en enda allel borttagning av Leishmania mitokondriell järn transportör genen (LMIT1) försämrar den Leishmania amazonensis mutant stammen LMIT1/ΔLmit1 förmåga att växa inuti BMMs, återspeglar en drastisk minskning i virulens jämfört med vildtyp. Denna analys kan också exakt kontroll av experimentella betingelser, som individuellt kan manipuleras för att analysera påverkan av olika faktorer (näringsämnen, reaktiva syreradikaler, osv.) på värd-patogen interaktionen. Därför ger lämpligt genomförande och kvantifiering av BMM infektion studier en icke-invasiv, snabb, ekonomisk, säker och tillförlitlig alternativ till konventionella djurmodell studier.

Leishmania har två smittsam - metacyclic promastigotes som skiljer från procykliskt promastigotes på den stationära fasen av kultur och amastigotes, som är de intracellulära stadierna (figur 1). I vissa Leishmania arter såsom L. amazonensis, kan amastigotes också differentieras i axenic kultur genom att skifta promastigote cellerna lägre pH (4.5) och förhöjd temperatur (32 ° C), villkor som liknar de som finns inuti BMM ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Alla patogena Leishmania arter uppehålla och replikera inuti makrofager av deras ryggradsdjur värdar. Här presenterar vi ett protokoll för att infektera murina benmärg-derived makrofager i kultur med Leishmania, följt av exakt kvantifiering av intracellulära tillväxt kinetik. Denna metod är användbar för att studera enskilda faktorer som påverkar värd-patogen interaktion och Leishmania virulens.

Kvantifiering av intracellulära tillväxt inuti makrofager är en snabb och tillförlitlig metod för att bedöma virulens Leishmania parasiter

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo avbildning av Transgena Leishmania parasiter i ett Live-värd

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protokoll för produktion av en genetisk kors av parasiterna Gnagare Malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En parasit Rescue och Transformation analys för Antileishmanial screening mot intracellulära<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Human akut monocytisk leukemicellinjen

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Inrättande av en<em&gt; In vitro</em&gt; System för att studera intracellulära Beteende<em&gt; Candida glabrata</em&gt; I Human THP-1 makrofager

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analys för kvantifiering av intracellulär mykobakteri anpassad för screening med högt genomströmning/högt innehåll

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: hög kapacitet Kvantifiering av Colony Tillväxt och Lag Tid

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Bedöma Antifungal aktivitet av isolerat alveolära makrofager av konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Tillämpa ett inducerbart uttryck system att studera Störningar av bakteriell Virulensfaktorer med intracellulära signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifiering av virulens markörer för Mycobacterium abscessus för intracellulär replikering i fagocyter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...