Name: ammonia fiber expansion (afex) pretreatment of lignocellulosic biomass
Uploaded: 2020-04-18T13:00:00
Duration: 9 min 30 s
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本材料部分基于五大湖生物能源研究中心、美国能源部科学办公室、生物与环境研究办公室（编号为 DE-SC0018409 和 DE-FC02-07ER64494）的工作。丽贝卡·翁承认密歇根州理工大学（启动资金）的部分支持。Shishir Chundawat 承认美国国家科学基金会 CBET 奖 （1604421）、ORAU 拉尔夫·波韦奖和罗格斯工程学院（启动资金）的部分支持。Bruce Dale 承认密歇根州立大学 AgBio 研究办公室以及美国农业部国家粮食和农业研究所的部分支持。文卡泰什·巴兰承认得克萨斯州和休斯敦大学（创业基金）的部分支持。MBI 员工承认美国能源部和密歇根州立大学基金会的部分支持。最后，我们谨将本文献给我们的导师和合著者布鲁斯·戴尔教授，以激励我们共同追求我们创造可持续纤维素生物燃料的梦想。

1. 调整生物质水分含量
<ol><li>参见材料表，概述使用定制的管状 AFEX 反应器执行工作台或实验室秤 AFEX 预处理所需的所有主要设备和材料（图2）。</li>
	<li>使用水分分析仪或设置为 105°C 的烤箱，确定生物质的总水分含量，8 小时。对于烤箱方法，将样品转移到耐热干燥器冷却，以防止在干燥前吸水。以重复或三脚三合一的方式执行该过程，并计算平均水分含量。</li>
	<li>对于反应堆中给定的干生物量载荷（此处，它可容纳 25 g），使用步骤 1.2 中确定的水分含量来计算需要加载多少湿生物量。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57488/57488eq1.jpg">[1] m湿= 生物量总质量（湿重量基础）;m干燥= 干重的生物质质量;MCTWB = 总重量的生物量水分含量</li>
	<li>在塑料容器中权衡出这种量的生物量（m湿）。</li>
	<li>计算需要与湿生物量混合多少水，以实现所需的水分含量。对于玉米炉，这通常是每克干生物量0.6克H2O。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57488/57488eq2.jpg">[2] 其中m水= 添加到反应器中的水质量（除了生物量中的水）;x水= AFEX 水负载（g：g 干生物量）</li>
	<li>使用喷雾瓶，缓慢地将这种水量（m水）添加到以前称重过的生物量中，然后用手混合好。</li>
</ol>2. 装载和组装反应器
<ol><li>通过在反应器管底部放置一个盖和特氟龙垫片来组装反应器体。将夹子固定到位，使用拉切均匀地拧紧两个螺母。</li>
	<li>将湿生物量转移到组装的反应堆底座，并在生物质顶部放置一个玻璃羊毛塞。</li>
	<li>将特氟龙垫片放在反应器顶部。确保该区域没有生物质和玻璃羊毛，这可以防止有效的密封，并将反应器头放在顶部，通过玻璃羊毛和生物量操纵热电偶。</li>
	<li>用两侧均匀的棘轮将夹具固定在反应器顶部。</li>
	<li>称量反应器（m反应器），并记录重量。</li>
</ol>3. 设置反应器系统并填充氨输送油缸
<ol><li>确认所有设备都已插入并可操作（温度控制器、温度监测器、注射器泵、计时器）。</li>
	<li>将计时器设置为每个反应堆和要运行的样品所需的停留时间。</li>
	<li>打开，如果使用可编程注射器泵，则在注射器泵上设置氨输送方法。 第 1 步：退出。 第 2 步：等待 15 秒（留出打开和关闭阀门的时间）。 第3步：注入（将氨输送到反应器中）。<ol>
<li>保存为AFEX方法，以便轻松重复使用。</li>
	</ol>
</li>
	<li>验证进出小氨气缸的所有阀门是否关闭。</li>
	<li>如果气缸以前使用过，并且含有残余氨/氮，则缓慢打开小氨气缸顶部的阀 A 以排出任何氮气，并在液氨开始喷出后关闭阀门。</li>
	<li>要填充小氨气缸，请打开氨管上的大型无水氨气缸和所有阀门。在小氨气瓶顶部附近缓慢打开阀门 （B），直到压力稳定。等待 5 分钟，然后继续下一步。在此期间，大约 120 mL 的氨从主油缸向输送油缸充电。</li>
	<li>关闭氨罐和小氨气缸之间的所有阀门，从左到右工作，从小缸（阀 B）开始，在油箱顶部的主阀上精加工。</li>
	<li>将氮调节器设置为 350 psi。打开氮气缸上的阀门和附加调节器上的阀。打开气门C的小氨缸慢慢加氮，给系统加压。根据需要，通过调整调节器上的设定点，将小气缸的压力调整到 350 psi。在分配氨时保持氮管管打开。</li>
</ol>4. 预热反应器（反应温度为 >100 °C）
<ol><li>将温度监视器插入热电偶和加热胶带到温度控制器。</li>
	<li>手动调节温度控制器，使反应器高达 60°C。</li>
</ol>5. 用氨装入反应堆
<ol><li>如果尚未打开，请打开注射器泵。</li>
	<li>根据所需的氨载荷（g：g 干生物量）和先前确定的氨校准计算所需的氨量。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57488/57488eq3.jpg">[3] 注：由于氨泵在体积上负载，因此在首次使用时，校准以从所需质量转换为体积。按照 AFEX 相同的步骤，但在装载氨和称重反应器后立即停止运行（排放反应器）。按照相同的步骤卸载反应堆。</li>
	<li>设置方法以装载正确的氨量：<ol>
<li>从第 3.3 节中选择AFEX方法。</li>
		<li>按步骤定义 |步骤： 1 |设置目标卷或时间。</li>
		<li>使用数字键盘在 mL 中所需的音量中键，然后按绿色复选标记。</li>
		<li>如果需要超过 85 mL，请输入目标体积作为电子表格中指定数量的一半，并使用相同的注射器体积填充反应器两次。</li>
		<li>重复步骤 5.3.2 到 5.3.4 的"步骤：3"。</li>
		<li>按后退按钮。</li>
	</ol>
</li>
	<li>向排气口打开小氨气缸底部的阀 （D），然后在任何残留氨退出后将其关闭。</li>
	<li>注射器泵末端的开阀 （E） 朝向烟罩前部，然后打开阀 （F） 以释放任何残留的氨。关闭阀 （E） 和 （F）。</li>
	<li>断开反应器与温度监视器和温度控制器的连接。将反应器连接到快速连接。</li>
	<li>向小氨缸打开阀 （D），向小氨缸打开阀 （E）。</li>
	<li>按泵上的绿色箭头启动序列，并将氨气绘制到注射器中。</li>
	<li>当注射器自动停止等待期间，将注射器阀 （E） 转向反应器，将反应器进气阀转向快速连接阀。 延迟后，注射器将开始注入，在设定点自动停止。</li>
	<li>如果需要超过 85 mL 的氨，重复步骤 5.7 到 5.9。</li>
	<li>关闭反应器阀和阀 （D）。打开阀门 （F） 从注射器中释放残留的氨，然后关闭阀 （F） 和关闭阀 （E）。</li>
	<li>向排气打开阀 （D），然后在残余氨离开后将其关闭。</li>
	<li>戴上低温手套，从快速连接中取出反应器。小心潜在的氨喷雾。如有必要，使用大象树干通风管管管管管排出释放的氨。</li>
	<li>启动相应反应器的计时器。</li>
	<li>称重反应器单元，根据电子表格计算验证氨是否添加了适当的重量。</li>
</ol>6. 开始加热并监测反应
<ol><li>将温度监视器插入热电偶和加热胶带到温度控制器。</li>
	<li>记录加氨后反应器的初始温度和压力（停留时间的开始）。</li>
	<li>手动调整温度控制器，使反应器高达设定温度。目标是在 <5 分钟内到达设定点。</li>
	<li>每 3 分钟记录一次反应器的压力和温度，直到停留时间结束。</li>
	<li>在停留时间结束时，断开反应器与温度控制器和热电偶的连接，将反应器从支架上取下，然后慢慢打开烟罩内的球释放阀。 注：此步骤中始终佩戴面罩。</li>
</ol>7. 关闭系统
<ol><li>让反应堆冷却几分钟后，使用棘轮扳手打开反应堆上的夹子。</li>
	<li>将生物质和玻璃羊毛从反应堆中卸下，装在烟头内。为了防止残留氨蒸发时生物量在空气中受到污染，最好在通风空间内封闭的干燥箱内干燥。</li>
	<li>用蒸馏水清洁反应器，直到水变清，让反应堆干燥。</li>
	<li>如果仍然打开，关闭所有阀门并连接到氨气缸。</li>
	<li>关闭氮气管路上的所有阀门。</li>
	<li>关闭温度控制器、温度监测器、平衡器、注射器泵和定时器。 注意：如果计划运行更多的反应，则无需排放小氨气瓶。但是，如果没有计划进行更多的实验，为了安全，最好在实验结束时将小圆柱体排放到发动机罩中。执行此操作时，保持阀门打开状态非常重要，因为氨的释放可能导致冰层形成，而冰块可能会阻塞某些管路。当线路解冻时，可以释放额外的氨。务必确保通风工作正常，同时允许系统通风。任何经过氨处理的生物量，即使不打算使用，也必须在烟罩中干燥过夜，以便残留的氨蒸发。它不能立即在垃圾中处理。</li>
</ol>

几位作者（即Shishir P S Chundawat、Tim Campbell、法扎内·泰穆里、莱昂纳多·苏萨、布鲁斯·E·戴尔、文卡泰什·巴兰）是MSU/MBI在氨预处理和反应堆设计方面申请多项专利的发明者/共同发明人。

AFEX 协议描述了如何在高温度下在无水氨和水存在的情况下处理植物材料，以提高纤维解酶和/或微生物预处理材料的消化性。AFEX在克霉素单体品种（例如，玉米制虫、转草、虫草、稻草、麦秆和甘蔗渣）上非常有效，因为在这些材料中天然丰富的酯状连接的过程效率很高。AFEX在从二甲醚和健身房（硬木、软木和本地杏）衍生的生物量上效率要低得多，32，33，,33因为基于木质素碳水化合物的酯链比例较小。然而，当这些联系被引入木本细胞壁使用植物生物技术，AFEX预处理过程变得更加有效34。
酯链的裂解允许从材料中去除某些生物量成分，但作为提取物重新沉积在外细胞壁表面，形成纳米级孔，促进纤维解酶的渗透和作用6。AFEX 预处理的玉米质质后，与未经处理的材料相比，在高固体条件下酶水解后，葡萄糖和木糖的释放率大约增加了3倍。与稀酸预处理35相比，氨预处理产生的抑制降解产物更少，抑制性降低。先前对AFEX和稀酸处理玉米炉的比较显示，稀酸预处理产生的酸含量比AFEX36多316%，芳烃多142%，furan醛含量增加3，555%，所有这些都可以抑制微生物35，37。,37由于 AFEX 是一个干到干的过程，因此在酶水解过程中，糖作为稀释的液体流不会损失。然而，这确实会导致并发症，因为具有纤维素降解和半纤维素降解能力的酶需要在酶水解期间完全分解细胞壁多糖，转化为葡萄糖和木糖等混合发酵糖。据报道，血红素寡聚物抑制纤维素活性38，这可能需要更高的酶负荷，以保持高最终糖产量。然而，优化合适的酶鸡尾酒可以减少AFEX预处理生物量39、40、41、42、43、44、45的糖化过程中的整体酶使用。39,40,41,42,43,44,45在AFEX预处理过程中，酯连接的水解和氨基酶解导致预处理生物量（如醋酸/乙酰胺、铁氧体酸/硫酰胺、焦马酸/焦霉酰胺）36中酸和酰胺产物的形成。虽然内层的形成已被证明有助于发酵过程，但如果喂养动物预先处理过生物马，它们在预处理原料中浓度非常高可能是一个问题。在AFEX预处理之前，与碱（如NaOH或Ca（OH）2等2 酯链的预水解可用于解决问题。
在 AFEX 过程中使用无水氨时，需要考虑许多安全注意事项。无水氨与密封中使用的铜、黄铜、铝、碳钢和常用氟弹性聚合物（如 Viton 等）发生反应。任何可能接触氨的管或反应器部件都应由不锈钢制成，并且垫片、阀座和快速连接密封件应尽可能由特氟龙或 Kalrez 制成。氨不被认为是一种有毒的化学物质，但它仍然是危险的，因为它的吸湿和低温性能。它很容易瞄准并严重损害眼睛和呼吸系统的粘膜。氨是一种低温流体，氨泄漏会由于与气流或冷冻设备直接接触而造成严重的冻伤。氨在浓度超过 300 ppm 时立即对生命和健康 （IDLH） 造成危险。如果浓度超过 50 ppm，工人应立即撤离。建议操作员佩戴校准的氨监测仪，以警告其附近存在危险浓度。还建议在主工作区安装带报警器的传感器。处理氨的工人应接受适当培训，并佩戴防护装备，如装有甲基胺盒的逃生呼吸器、低温和防热手套，并做好应对紧急情况的准备。如果接触无水氨，操作员应转移到安全地带，并立即向受影响区域冲水至少 15 分钟。氨预处理过程应在烟气罩内进行，氨气瓶应储存在通风罩或通风柜中。实验后，经过预处理的生物量将具有一些残留的游气氨，应在发动机罩中干燥过夜或在定制通风干燥箱中干燥，然后储存在室温的塑料袋中进行后续实验。其他一些关键安全注意事项包括安装带有流量计的氨输送系统，以帮助精确向反应器输送氨，以及设计处理预处理过程压力至少 1.5 倍的反应堆（例如，在 2 x 106 Pa 压力下处理 AFEX 过程，反应器的最低压力额定值应为 3 x 106 Pa）。
AFEX 预处理是生产高度可消化的植物生物量的有前途的方法，可以直接用作动物饲料或作为原料来产生燃料和化学品。除了这两个行业之外，AFEX 可能还会在其他领域使用，例如生物可再生原料生产生物材料，或用作生产沼气的原料。实验室规模过程可以在配备适当通风空间和安全预防措施的实验室中进行，我们目前的工作证实，这种缩小的AFEX工艺与放大和/或试验式AFEX反应堆中产生的材料相似。实验室规模的 AFEX 流程可用于以更高的吞吐量方式测试原料、处理条件和应用程序，同时对该流程在试点或工业规模下的性能提供合理的预期。

氨纤维膨胀（AFEX）是一种热化学预处理，以挥发性氨为主要反应物，用于纤维素生物量预处理。这个过程最初是由布鲁斯·戴尔发明的，目的是以经济方式有效地减少利诺塞洛西生物量的顽固性，并将生物催化预处理的生物量解构转化为可发酵糖11，2。2与大多数其他水基热化学预处理3不同，AFEX是一种干干过程，在生物质成分上不会产生显著变化，并且不需要与相关的废物产生和费用一起清洗步骤。在试验规模上已经证明了过量挥发性氨的回收，从而减少了废物的产生和加工成本。MBI开发的试验式包装床AFEX反应系统（图1）使用蒸汽剥离回收残余氨，并将热浓缩氨转移到新的包装床4,4，5。在AFEX预处理后，少量氮纳入生物质，由反胃动物和微生物用作非蛋白质氮。此外，通过改变生物量超结构通过各种物理化学机制6,6，7，8，AFEX增加生物量对碳水化合物活性酶（CAZymes）的可及性，并将多糖水解率提高几倍7,88，9，9这也增加了反胃动物通过其纤维8化微生物群4，10，11，1210,11,12的消化能力。4长期以来，农民一直采用这种方法的更简单版本，通过在低无水氨负荷（+lt;4% 和干生物量基础）和环境压力和温度10，11,11的情况下，在塑料油布下孵育生物量数天或数周，提高反胃动物的消化能力。
无水氨在20世纪50年代首次被调查为可能伪造木材，并在1970年代早期作为制浆化学品，在13，14，15，16，17，18。13,14,15,16,17,18在20世纪80年代初，在亚临界条件下首次使用加压、高温、浓缩氨（>30%NH4OH），以提高利诺纤维素生物量19的酶消化性和微生物发酵性。这个过程经历了几个名称的变化，多年来，从氨冻结爆炸，然后氨纤维爆炸，最后，氨纤维膨胀，或简单的AFEX。大约在同一时间（20世纪80年代中期），杜邦（现为陶氏-杜邦）也探索采用超临界和近临界无水氨预处理工艺，以提高生物量20、21、2221,22的消化能力。20近几十年来，人们日益重视使用稀释水氨溶液作为预处理试剂，包括氨回收/渗透23（ARP）、浸泡在23水氨（SAA）或陶氏-杜邦工艺中，无氨回收24。其他几种方法研究使用无水氨（低水分无水氨（LMAA）和低液氨预处理25。在过去几年中， 最近研制出两种利用液无水氨26、2727和氨盐基溶液的新型先进有机素式预处理技术，在高液到固体负荷26下，在超低酶载荷下，可选择性木质素分馏和高效酶水解预处理纤维素生物量。最近一篇评论文章强调了各种形式的氨基预处理方式之间的相似性和明显差异29。然而，直到最近4年，还没有试验规模的氨基预处理工艺（如AFEX）有效地与封闭循环化学回收集中氨使用的过程。
在本文中，我们详细介绍了最常用的AFEX协议，用于在实验室尺度上预处理纤维素生物量，以产生经过预处理的生物量的克尺度（例如，1至几100克）。通常，生物质与水混合（0.1~2.0 g H2O/g 干生物量），并加载到定制的不锈钢管状或帕尔型反应堆中。然后，将无水氨（0.3~2.0 g NH3/g 干生物量）添加到反应器中，将混合物加热到所需的反应温度（60~180°C）。1980-1990年代AFEX工艺的早期出版物在温度升高后立即启动了预处理居住时间（例如5-60分钟）。然而，当氨添加到反应器后，反应就会发生，目前的AFEX程序是在向反应器添加氨后立即开始监测停留时间。对于 90°C 或更高的温度，通常需要在装载氨之前预热生物质，以使初始温度上升到最短的时间段（即 <5 分钟）。在停留时间完成时，阀门打开以快速释放压力，并将气相含量放入合适的化学烟气罩中。氨从液体到气相的快速转换也使反应器冷却。小型反应堆（<100 mL反应堆体积）通常可以立即卸载在烟罩中，而较大的反应堆（>100 mL反应堆体积）可能需要额外的冷却时间。为了用户安全，在更大范围内（每台反应器运行的100克氨），建议用氮气清除尽可能多的残余氨，并在卸载前帮助冷却反应器内容物。通常，在实验室规模上不尝试回收和/或回收氨。扩大AFEX预处理工艺的关键设计挑战之一是以最低的资本和运营成本回收氨。此外，在生物质中添加液氨通常会导致冷却生物量的液体部分闪烁，需要在AFEX处理开始之前加热生物质-氨混合物。在生物质中添加氨蒸气不是添加氨，而是具有两个优点：第一，散装生物质的高孔隙度允许氨蒸气快速输送，甚至导致氨在整个生物质中分布。其次，氨蒸气容易和蒸发溶解到潮湿的生物量中，从而产生热能迅速均匀地加热生物质。为了利用这些优势，MSU Dale 实验室和 MBI 都开发了使用氨蒸气的 AFEX 处理方法。戴尔实验室开发了气态氨预处理（GAP）工艺30，MBI开发了包装床AFEX反应器工艺（图1）4，已在试验规模上4进行了演示。包装床AFEX反应器系统能够半批量模式运行，使用蒸汽剥离方法44、55完全回收氨。这种新型的MBI试验规模工艺利用氨的化学和物理特性，在高效回收氨的同时，有效地预处理生物质。
在这里，我们介绍了使用定制的200mL体积管状反应器在实验室规模下对玉米定木进行AFEX预处理的详细大纲（图2）。AFEX 预处理样品被消化成可发酵糖，使用市售的纤维解酶鸡尾酒来证明预处理过程的有效性。实验室级AFEX反应堆的酶水解结果与较大的试验级AFEX反应堆产生的样品进行了比较。我们的目标是为实验室级加压反应堆的安全和一致运行提供标准操作程序，以便对玉米烤架等纤维素生物量进行AFEX预处理。有关此实验室级 AFEX 预处理过程（例如，试点式包装床 AFEX 流程）变化的其他支持信息，在随附的补充 pdf 文件中进一步突出显示。有关包装床 AFEX 流程操作步骤的详细报告将在单独的出版物中突出显示，并可应 MBI-MSU 的请求提供。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1275px;" width="1274">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safety Equipment/PPE</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:699px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonia Monitor</td>
			<td style="width:172px;">CanarySense</td>
			<td style="width:188px;">BW GAXT-A-DL</td>
			<td style="width:699px;">Single gas detector, Ammonia (NH3), 0 to 100 ppm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryogenic gloves</td>
			<td style="width:172px;">Amazon</td>
			<td style="width:188px;">B01L8WA238/B01L8WA1H0/B01L8WA1O8</td>
			<td style="width:699px;">Keep hands protected when handling liquid ammonia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ear muffs</td>
			<td style="width:172px;">3M</td>
			<td style="width:188px;">H7A</td>
			<td style="width:699px;">Ear muffs to protect hearing when releasing ammonia at end of pretreatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Face shield</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">Wear while handling ammonia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heat protective gloves</td>
			<td style="width:172px;">Grainger</td>
			<td style="width:188px;">2EWX1/2EWX2/2EWX3</td>
			<td style="width:699px;">Showa heat resistant gloves, max temperature 500&#176;F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrile gloves</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">Wear while mixing biomass to prevent contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:699px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anhydrous Ammonia Compressed Gas Cylinder</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">An anhydrous ammonia compressed gas cylinder with a dip tube is required for this process. The dip tube is essential in order to withdraw liquid ammonia from the cylinder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Distilled water</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milled or Chopped Corn Stover</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">Corn stover is not readily commercially available. Contact local farmers or agricultural extension if you wish to locate some.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen Compressed Gas Cylinder</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:699px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonia Cylinder Adapter</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">CGA fitting that depends on the gas cylinder. Matheson is a good source. Some require teflon gaskets. This connects the cylinder to the ammonia delivery system. A regulator is not necessary as the system uses liquid ammonia.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonia Delivery System (Figure 4)</td>
			<td style="width:172px;">Swagelok</td>
			<td style="width:188px;">Misc.</td>
			<td style="width:699px;">Stainless steel pressure cylinder and components, valves, check valves, and gauges were used for all lines potentially in contact with ammonia.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:172px;">Sartorius</td>
			<td style="width:188px;">CPA4202S</td>
			<td style="width:699px;">Balance used for preparing biomass and weighing the reactors. Toploading balance, 4200g x 0.01g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemraz O-rings</td>
			<td style="width:172px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:188px;">5013091</td>
			<td style="width:699px;">Ammonia-resistant o-rings for the SS syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Custom Tubular Reactors (Figure 3)</td>
			<td style="width:172px;">Parts were purchased from McMaster-Carr, Swagelok, Omega, and Motion Industries (Dixon Fittings)</td>
			<td style="width:188px;">Misc.</td>
			<td style="width:699px;">To be compatible with ammonia, the custom reactor was constructed from stainless steel components (sanitary tube and fittings, compression fittings, quick connect, pressure gauge, thermocouple), and teflon gaskets. The maximum pressure rating of the vessel is 1500 psig, which is the maximum pressure rating of the bolted sanitary clamps.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Drying Box</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">Optional: an enclosed system for drying is necessary if planning to do microbial experiments to avoid contamination. Avoid drying at elevated temperatures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Pressure Syringe Pump</td>
			<td style="width:172px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:188px;">70-3311</td>
			<td style="width:699px;">Infuse/Withrdraw PHD ULTRA HPSI Programmable Syringe Pump for transferring liquid ammonia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moisture Analyzer</td>
			<td style="width:172px;">Sartorius</td>
			<td style="width:188px;">MA35</td>
			<td style="width:699px;">Moisture analyzer for determining moisture content of biomass prior to pretreatment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen Delivery</td>
			<td style="width:172px;">Misc.</td>
			<td style="width:188px;">Misc.</td>
			<td style="width:699px;">Nitrogen compressed gas cylinder, inert gas regulator (at least 1000 psig max pressure rating), lines, and valves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ratchet wrench and 7/8&#34; socket</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">Ratchet and socket to quickly tighten and open bolts on the sanitary clamp. Can be purchased anywhere.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retractable Thermocouple Cables</td>
			<td style="width:172px;">Omega</td>
			<td style="width:188px;">RSC-K-3-4-5</td>
			<td style="width:699px;">Retractable thermocouple cable. You need one for each reactor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless Steel Syringe</td>
			<td style="width:172px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:188px;">702261</td>
			<td style="width:699px;">Stainless steel syringe for tranferring ammonia to the reactors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Temperature Monitor</td>
			<td style="width:172px;">Omega</td>
			<td style="width:188px;">HH12B</td>
			<td style="width:699px;">Dual input temperature monitor. You need one for every two reactors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Voltage Controller</td>
			<td style="width:172px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:188px;">6994K11</td>
			<td style="width:699px;">Variable-Voltage Transformer for controlling heating to the reactors. You need one for each reactor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Supplies</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:699px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal Scoops, Spoons and/or Spatulas</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">For transferring biomass for weighing, mixing, transferring into the reactor and removing from the reactor at the end of the run</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic Bowls or Tubs</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">Used for mixing the biomass with the water. Any bowl or tub could be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spray Bottle</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wide-Mouth Funnel</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td style="width:699px;">Any funnel that has a bottom opening 0.5-1.0 inches diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wooden Dowel</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td>1-1.5&#34; diameter wooden dowel to assist with loading/unloading the reactor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Wool</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">CLS3950-454G</td>
			<td>For packing the top of the reactor to prevent biomass escape and clogging the tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic Press-to-Close Bags</td>
			<td style="width:172px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:188px;">1959T24</td>
			<td>Bags for storing processed samples and for transferring to drying box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic Tote</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td>Used to transfer pretreated biomass to an alternate location for drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic Weighboats or Metal Trays</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
			<td style="width:188px;">-</td>
			<td>Used to catch the biomass when removing from the reactors, and for storing the samples while drying</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ammonia fiber expansion (afex) pretreatment of lignocellulosic biomass

利诺纤维素材料是植物衍生的原料，如作物残留物（如玉米制虫、稻草和甘蔗渣）和专用能源作物（如杂物和转草），大量可用于生产生物燃料、生化和动物饲料。细胞壁内嵌的植物多糖（即纤维素、纤维素和果胶）对转化为有用的产品非常顽固。氨纤维膨胀（AFEX）是一种热化学预处理，它提高了多糖到酶的可及性，用于水解成发酵糖。这些释放的糖可以在生物精炼厂中转化为燃料和化学品。在这里，我们描述了一个实验室规模的批次AFEX工艺，用于在克表上生产经过预处理的生物量，无需任何氨回收。实验室规模工艺可用于识别最佳预处理条件（例如氨载荷、水负荷、生物质载荷、温度、压力、停留时间等），并生成足够数量的预处理样品，用于详细的物理化学表征和酶/微生物分析。使用实验室级AFEX工艺预处理的玉米菌溶性水解产生的可发酵糖产量与类似预处理条件下的试验级AFEX工艺相当。本文旨在为实验室级反应堆的安全、一致地运行提供详细的标准操作程序，用于对结核纤维素生物量进行AFEX预处理。

在 AFEX 预处理后，生物量的颜色较暗，但在视觉上保持不变（图 3）。AFEX 工艺除了该协议中概述的量级外，还以各种比例生成高度可消化的材料。在这里，我们预处理相同的玉米菌制样品在我们的小200mL，包装床，长凳秤系统;一个更大的5加仑，搅拌帕尔反应堆;和MBI的试验反应堆两个较小的反应堆（即200mL和5加仑的刻度）用于的条件为1.0克NH3：g干生物量，0.6克H2O：g干生物量，在100±5°C下30分钟。在相同材料上试验级AFEX4，在0.6克NH3：g干燥生物量下，0.6克H2O：g干燥生物量，在100~5°C下30分钟。有关在更大范围内进行 AFEX 预处理的协议的详细信息，请参阅补充文件 1）。根据 AFEX 预处理的目标温度，制定了以下"质量控制标准"。如果到达设定点后，反应器温度从设定点超出 ± 10°C，则必须中止实验。如果在氨泵送后 5 分钟内未达到目标温度（5 °C 以内），则中止实验。此外，可以使用纤维解解酶鸡尾酒测试AFEX工艺的预处理功效，将可进入的多糖解解成发酵糖。样品在6%的葡胶加载、pH 5.0、50°C和250rpm的溶解液中，在摇动的培养箱中被酶化72小时。在固定总蛋白质载荷基础上，在15mg酶/葡糖中加载的固定总蛋白质载荷基础上，由60%纤维素（CTec3）：40%半纤维素（HTec3或NS22246）组成的酶的商业鸡尾酒用于所有糖化测定。结果表明，AFEX 预处理在所有情况下都能显著提高可发酵糖的产量.此外，使用实验室级AFEX工艺预处理的生物量纤维素/木兰水解产量可与较大的5加仑帕尔反应堆和MBI的试验式包装床AFEX工艺相媲美。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57488/57488fig1.jpg"> 图 1.MBI AFEX 反应堆的试验规模运行步骤大纲，用于预处理与高效氨回收完全集成的利诺塞洛素生物量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57488/57488fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57488/57488fig2.jpg"> 图 2.用于执行视频协议中概述的AFEX过程的A）氨输送系统和B）小型200 mL AFEX预处理反应器的原理图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57488/57488fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57488/57488fig3.jpg"> 图 3.与未经处理的生物量相比，AFEX 预处理的生物量与未经处理的生物量相比，其总形态非常相似，除了颜色略暗。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57488/57488fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57488/57488fig4.jpg"> 图 4.此处显示了在6%胶化液加载AFEX处理玉米炉后72小时酶水解后获得的葡萄糖和木糖产量。所有糖化测定均重复进行，此处报告的平均值 （m）。此处将标准差 （1s） 报告为误差条。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57488/57488fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
补充文件 1：其他协议<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57488/Supplementary_Information.pdf" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充表 1：氨输送系统和支柱框架<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57488/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>

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Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

氨纤维膨胀（AFEX）是一种热化学预处理技术，可将木体纤维素生物量（如玉米制积器、稻草和甘蔗渣）转化为生物燃料和动物饲料应用的高度可消化原料。在这里，我们描述了一种实验室规模的方法，用于对利诺纤维素生物量进行AFEX预处理。

氨纤维膨胀（AFEX）预处理利诺纤维素生物量

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

氨纤维膨胀预处理，也称为AFEX，是一种化学处理方法，可用于从植物细胞壁（也称为木纤维素生物量）中产生可再生燃料、化学品或动物饲料。虽然AFEX已用于各种纤维素材料，但它对草地和草本农业残留物最有效。在AFEX期间，高浓度氢氧化铵与生物量发生反应，以打破植物细胞壁中的酯连接，将纳米引入微尺度孔隙。这有利于细胞壁多糖的酶解构。最终结果是植物材料更容易生化转化为燃料和化学品，或可用作高度可消化的动物饲料。与其他预处理流程相比，AFEX 具有许多关键优势。首先，AFEX的用水量低，是相当独特的，因为它产生一个大部分干燥的材料，可以密度化和容易运输。AFEX 工艺还生产少量微生物抑制剂，如毛皮，使其与微生物发酵过程高度兼容。也可以回收大部分预处理化学氨，从而提高工艺经济性。在位于密歇根州兰辛的MBI试验工厂，试验规模AFEX预处理和氨回收已证明为每天1吨。以下协议将描述AFEX过程的实验室规模操作所涉及的步骤。展示这种技术将是雅各布阿瓜多，在我们的研究小组工作的本科生之一。首先，使用水分分析仪确定未经处理的生物量的水分含量。称出25克生物质，并使用喷雾瓶，使用蒸馏水调整植物生物量的水分含量，以达到您的目标水分含量。对于玉米棒，这通常是每克干生物质 0.6 克水。用手混合样品。通过在反应器管底部放置盖和特氟隆垫片来组装反应器主体。将湿生物质转移到组装的反应堆基座上，并在生物质的顶部放置一个玻璃羊毛塞。将特氟隆垫片放在反应器顶部。确保该区域没有生物量和玻璃羊毛，这些物质和玻璃羊毛可以防止有效的密封，并通过玻璃羊毛和生物质将反应器头放在顶部操纵热电偶上。使用棘轮均匀地将夹子螺栓固定在反应器顶部。称重反应器并记录重量。确认所有设备已接通并可操作，将计时器设置为每个反应器和要运行的样品所需的安装时间。打开可编程注射器泵，设置氨输送方法，方便起见。验证进入和退出小型氨气缸的所有阀门是否已关闭。如果以前使用过气缸并含有残留氨或氮气，则缓慢打开小氨气缸顶部的阀 A，以排出任何氮气，并在液氨开始喷出后关闭阀门。要填充小氨气缸，请打开大型无水氨气缸和氨管管内所有阀门。在小氨气缸顶部附近缓慢打开阀 B，直到压力稳定。等待五分钟，然后继续执行下一步。关闭氨罐和从左到右工作的小型氨气瓶之间的所有阀门，然后从小气缸阀 B 开始，在氨罐顶部的主阀上完成。将氮调节器设置为 350 psi。打开氮气缸上的阀和附加调节器上的阀。打开小氨气缸上的阀 C，在压力下缓慢添加氮气。通过调整调节器上的设定点，根据需要将小油缸的压力调整到 350 psi。在分配氨时保持氮管打开。对于大于 100 摄氏度的反应温度，您需要在添加氨之前预热生物质和反应器。将温度监视器插入热电偶，将加热胶带插入温度控制器。手动调节温度控制器，使反应器温度达到 60 摄氏度。根据所需的氨负荷和先前确定的氨校准计算所需的氨量。在注射器泵中设置方法，通过打开和关闭氨气缸底部的阀门朝排气口和注射器泵管上的阀门，从小氨气缸和注射器泵之间的管路中残留氨。断开反应器与温度监视器和温度控制器的连接。将反应器连接到快速连接。打开阀 D 朝向小氨气缸，阀 E 朝向小氨气缸。按下泵上的绿色箭头以启动序列，然后将氨吸入注射器。当注射器在等待期间自动停止时，将注射器阀转向反应器和反应器进气阀，以便它指向快速连接阀。延迟后，注射器将开始注入，在设定点自动停止。关闭反应阀和阀 D.打开阀 F 以从注射器中释放残余氨，然后关闭阀 F 并关闭阀 E.打开阀 D 朝排气口关闭，然后在残余氨离开后关闭。戴上低温手套时，请将反应器从快速连接上拆下。小心潜在的氨喷雾。启动相应反应器的计时器。称量反应器单元，以验证是否根据电子表格计算添加了适当的氨重量。将温度监视器插入热电偶，将加热胶带插入温度控制器。记录添加氨后反应器的初始温度和压力。手动调节温度控制器，使反应器达到设定温度。目标是在五分钟内到达设定点。每三分钟记录一次反应器的压力和温度，直到居住时间结束。在居住时间结束时，断开反应器与温度控制器和热电偶的连接，将反应器从支架上拆下，然后缓慢打开烟气罩内的球释放阀。在此步骤中，始终佩戴面罩。让反应器冷却几分钟后，使用棘轮扳手打开反应器中的夹子。在烟罩内从反应器中卸载生物质和玻璃羊毛。为了防止残留氨蒸发时生物质的空气中污染，最好在通风空间内封闭的干燥箱内干燥生物质。如果仍然打开，则关闭所有打开的阀门并连接到氨气缸和氮气管线上的所有阀门。在 AFEX 预处理后，生物量的颜色会变暗，但在视觉上保持不变。AFEX 除了本协议中概述的材料外，还可在各种尺度上生成高度易消化的材料。我们使用 200 毫升包装床台秤系统、5 加仑搅拌动力反应堆和 MBI 的先导反应器预处理相同的玉米 stover 样品，该反应堆每天能够处理 1 吨生物质。两个较小的反应堆使用的条件是每克干生物质1克氨，每克干生物质0.6克水，在100摄氏度下30分钟。试验规模AFEX在相同条件下对同一材料进行，但氨负荷为每克干生物质0.6克氨。样品在6%葡萄糖负荷、5摄氏度、50摄氏度和250转/分的震动培养箱中以72小时进行酶水解。酶的商业鸡尾酒被加载，包括60%大提琴酶和40%半纤维素酶，每克葡萄糖15毫克的酶蛋白。我们的结果表明，与未经处理的生物量相比，AFEX预处理可显著提高可发酵糖的产量。此外，使用这三种工艺预处理的生物量的72小时水解产量相互可比。按照AFEX工艺，预处理材料可以无限期地储存，只要它们保持干燥，并用于各种转化实验，如高固体酶水解和发酵，综合生物处理或动物饲料试验。实施AFEX期间，一个关键的考虑因素集中在安全使用无水氨。AFEX 实验应始终在通风空间内进行，研究人员应采取适当的安全预防措施，防止氨暴露，并熟悉在紧急情况下如何应对。总之，氨纤维膨胀预处理是减少生物质顽固性，并更有效地利用可再生植物原料生产燃料、化学品和动物饲料的一种很有前景的方法。

Research

JoVE Journal

Environment

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

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总木质素，木质素单体，和酶促糖推出：顽拗变奏曲在木质纤维素生物质的高通量筛选

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