Name: preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts at JoVE.com

Recherche au SNU est pris en charge par le National Research Foundation (NRF) par le MEST de Corée pour les subventions de tumeur microenvironnement Global Core Research Center (GCRC), [numéro de licence 2011-0030001] ; par la subvention de recherche de l’Université nationale Séoul et cerveau Corée (BK21) programme.

1. colonie Formation essais
<ol><li>Cellulaire de cellules A549 culture à une concentration de 20 000 cellules/cm2 dans 15 mL de RPMI1640 milieu de culture enrichi avec 10 % SVF (sérum de veau fœtal) et 1 % antibiotiques dans une fiole de2 75 cm dans un incubateur à CO2 à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Le jour de l’expérience, déterminer la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre. Recueillir 50 000 cellules par centrifugation à 400 g pend...

<ol>
	<li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer.">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li><li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+cancer+research.">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li><li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models:+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs.">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li><li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+3D+culture+models+of+cancer.">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li><li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one):+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation.">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER/Golgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer.">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation.">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma.">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids.">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer.">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li></ol>

Les tarifs de la formation de colonies obtenues avec MCBM dépend du type de cellule. Généralement, pour les cellules non adhérentes, le nombre de colonies est beaucoup plus élevé par rapport aux cellules adhérentes. Nous avons observé que les cellules A549 forment des colonies de 30 à 40 après 10 jours. Précédemment, nous avons rapporté des cellules leucémiques différents que le nombre de colonies est entre 200 et 2509. Nos résultats ont montré que OT48 seul n’a pas produit une ...

Le cancer est causé par des mutations cellulaires et par conséquent les voies biochimiques de signalisation sont perturbées déclenchant la division cellulaire incontrôlée et la résistance à la mort cellulaire. Les tumeurs interfèrent avec les fonctions physiologiques de l’appareil digestif, nerveux, circulatoire et par la suite voisine tissus1. Malgré les efforts de recherches approfondies, le cancer reste la maladie mortelle la plus répandue dans le monde2. Médecine de précision a été reconnue comme la Fondation de l’avenir thérapeutique anticancéreuse. Nouvelles entités moléculaires sont systématiquement testées en association avec les médicaments existants pour améliorer les résultats cliniques.
Cependant, une des limitations importantes associées au développement de nouvelles thérapies ciblées efficaces est l’échec des tests couramment utilisés pour simuler les résultats biologiques exacte de drogue exposition3. Découverte de drogue de cancer repose encore principalement sur l’évaluation de l’efficacité des agents thérapeutiques dans des lignées de cellules cancéreuses cultivées dans des cultures monocouches 2D, qui sont difficiles à valider dans les essais cliniques4. Par conséquent, il y a un intérêt croissant pour développer des modèles de cancer mieux que mieux imitent les fonctionnalités natives de tumeurs in vivo5. Ces dernières années, un intérêt croissant pour les modèles 3D de la culture a mené à l’élaboration de méthodologies améliorées pour produire la tumeur 3D modèles5.
Ici, nous présentons une méthode avec trois techniques de culture cellulaire 3D différents permettant d’améliorer la compréhension de la puissance de l’hydroxycoumarine OT486 en combinaison avec BH3 mimétiques avant plus en profondeur des essais in vivo sur. Notre méthode se compose de la combinaison de la colonie et SFAs avec un in vivo tumeur formation test basé sur un modèle de poisson zèbre pour valider l’efficacité de la combinaison de OT48 et BH3 mimétiques dans les cellules cancéreuses du poumon et surveiller la progression du cancer dans sa vie organisme.
Tests de formation de colonie sont couramment utilisés pour évaluer l’efficacité des agents anticancéreux cancers solides tant que hématopoïétiques. Le test détermine la capacité d’une cellule à proliférer indéfiniment et forment des colonies7. L’effet d’un agent anticancéreux sur la colonie formant la capacité des cellules est déterminée par la diminution du nombre ou de la taille des colonies.
Sphéroïdes représentent des modèles in vitro de tumeur et servent de plateforme de dépistage peu coûteux pour les agents anticancéreux. Sphéroïdes sont des agrégats de cellules cultivées en suspension ou noyées dans une matrice 3D. Cette approche est largement utilisée pour le dépistage des drogues et des études de tumeur immunitaire, la prolifération et la croissance interaction8.
Pour bien comprendre les propriétés d’un nouveau médicament, il est essentiel de mener des expériences in vivo sur des rongeurs. Toutefois, cette méthode traditionnelle est coûteux et prend du temps. Ces dernières années, poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme de laboratoire étudiés qui est moins cher et plus rapide d’élever. Tumeurs développées dans l’approche de la culture cellulaire zebrafish représentent un 3D mais dans le cadre de in vivo d’un vertébré9.
Au total, on utilise ici trois approches différentes culture 3D y compris SCFA, SFAs et poisson-zèbre in vivo la formation de tumeurs pour démontrer la capacité anticancéreuse de hydroxycoumarine OT48 dans un modèle de cellules A549 le cancer pulmonaire en combinaison avec BH3 mimétiques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials required for colony formation assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>37 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>30096</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1520-500</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70075</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>Tube-170-C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Hyundai Micro</td>
			<td>H20015</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30012</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>4230</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5622</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS4000</td>
			<td>GE Healthcare Technologies</td>
			<td></td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials required for spheroid formation assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>37 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>30096</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1520-500</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70075</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3474</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials required for zebrafish xenografts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>37 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>30096</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1520-500</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T25</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70025</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70075</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T175</td>
			<td>SPL</td>
			<td>71175</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>Tube-170-C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30024</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10100</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71382</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2773</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7001</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW 100F-4</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter instrument, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>KOVAX</td>
			<td>1ml</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>HSU-1000612</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DE/DM 5000B</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts

Projection pré-cliniques in vitro et in vivo de nouveaux agents thérapeutiques sont un outil essentiel dans la découverte de médicaments du cancer. Bien que les lignées cellulaires cancéreuses humaines répondent à des composés thérapeutiques en culture cellulaire monocouche (dimensionnelle) 2D, systèmes de culture 3D ont été développés pour comprendre l’efficacité des médicaments dans des modèles plus physiologiquement pertinents. Ces dernières années, un changement de paradigme a été observé dans la recherche préclinique pour valider l’efficacité de nouvelles molécules dans les systèmes de culture 3D, plus précisément imitant le microenvironnement tumoral. Ces systèmes de caractérisent l’état de la maladie d’une manière plus physiologiquement pertinente et aident à gagner mieux mécaniste perspicacité et la compréhension de l’activité pharmacologique d’une molécule donnée. En outre, avec la tendance actuelle dans l’amélioration des modèles de cancer en vivo , poisson zèbre est devenue un important modèle de vertébrés pour évaluer in vivo la formation de tumeurs et d’étudier l’effet des agents thérapeutiques. Ici, nous avons étudié l’efficacité thérapeutique de hydroxycoumarine OT48 seul ou en combinaison avec BH3 mimétiques dans la lignée de cellules cancéreuses du poumon A549 à l’aide de trois systèmes de culture 3D différente, y compris les essais de formation de colonie (CFA), essai de formation sphéroïde (SFA) et en vivo zebrafish xénogreffes.

Dans la Figure 2, le cancer du poumon cellules ligne A549 a été ensemencé dans MCBM à former des colonies après le traitement avec OT48 seul ou en combinaison avec BH3 A1210477 mimétique aux concentrations indiquées. Les résultats ont montré que la combinaison significativement réduit nombre, la taille et la surface totale des colonies, après 10 jours d’incubation.
Dans la <strong class...

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Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Évaluation préclinique de la bioactivité de la OT48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie Formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre

Nous présentons ici la projection préclinique des coumarines anticancéreux à l’aide de poisson-zèbre et la culture 3D.

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

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