Name: preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts at JoVE.com

ソウル大学での研究、腫瘍微小環境グローバル コア研究センター (画する) 助成、[許可番号 2011 0030001]; 韓国の MEST 国立研究財団 (NRF) によってサポートされてソウル国立大学研究助成、頭脳韓国 (bk 21) プログラム プラス。

1. コロニー形成アッセイ
<ol><li>20,000 セル/cm2 RPMI1640 の 15 mL の濃度で培養 A549 細胞 10 添加培養液中の細胞 %fbs (ウシ胎児血清)、37 ° C、5% CO2で CO2インキュベーターで 75 cm2フラスコで 1% の抗生物質。</li>
	<li>実験の日、診断を使用して、セルの濃度を決定します。1.5 mL 遠心チューブに 7 分間 400 × gで遠心分離によって 50,000 の細胞を収集し、再 1 x 滅菌 PB...

<ol>
	<li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer.">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li><li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+for+cancer+research.">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li><li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models:+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs.">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li><li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+3D+culture+models+of+cancer.">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li><li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one):+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation.">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER/Golgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer.">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation.">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li><li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma.">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li><li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids.">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer.">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li></ol>

MCBM で得られたコロニー形成率はセルの種類によって異なります。通常、非付着細胞のコロニー数は付着細胞へと比較してはるかに高い。A549 細胞が 10 日後 30 に 40 コロニーを形成したことがわかった。以前、コロニーの数は 200 に 2509の間別の白血病細胞で報告しています。私たちの結果は、OT48 だけが単独でコロニー数の大幅な減少を作り出さなかった。ただし、BH3 と組?...

がんは細胞の突然変異によって引き起こされ、生化学的なシグナル伝達経路が中断された結果として制御されていない細胞分裂および細胞死への抵抗をトリガーします。腫瘍は、消化器系、神経系、循環系、その後隣接組織1の生理機能を妨げます。広範な研究努力にもかかわらず癌世界2の最も一般的な命にかかわる病気のままです。精密医学は、今後のがん治療の基盤として認識されています。新しい分子の実体は、臨床結果を改善するために既存の薬剤との組み合わせで定期的にテストされます。
ただし、新しい効率的なターゲットを絞った治療法の開発に関連する重要な制限の 1 つは薬物暴露3の正確な生物学的結果をシミュレートするために一般的に使用される試金の失敗です。ガン創はまだほとんど臨床試験4で検証することは困難である 2次元単層培養で培養したがん細胞株における治療薬の有効性のテストに依存しています。したがってより体内の腫瘍5のネイティブの機能を模倣するより良いがんモデルを開発する関心の高まりがあります。近年、3次元培養モデルに対する注目が高まって結果 3 D 腫瘍モデル5を生成する改善された方法論の開発。
深さ体内アッセイにより前に BH3 模倣との組み合わせで hydroxycoumarin OT486の力の理解を改善することができます 3 つの異なった 3 D 細胞培養の技術と手法を紹介します。本論文では、生体内で腫瘍形成テストでさらに肺癌細胞 OT48、BH3 オノマトペの併用の有効性を検証し、生活で癌の進行を監視するゼブラフィッシュ モデルに基づく植民地と SFAs を組み合わせた生物。
コロニー形成法は、日常的に両方の固体だけでなく、造血の癌に対する抗癌剤の有効性を評価するために使用されます。アッセイは、無限に増殖し、コロニー7を形成する細胞の能力を決定します。コロニー形成細胞の能力に及ぼす抗悪性腫瘍剤は、数の減少および/またはコロニーのサイズによって決定されます。
回転楕円体体外腫瘍モデルを表し、抗がん剤のスクリーニング低コストのプラットフォームとして。回転楕円体は、懸濁液中の成長の細胞の集合体をまたは 3 D マトリックスに埋め込まれています。このアプローチは、薬剤のスクリーニングおよび腫瘍の成長、増殖と免疫の相互作用のための8の研究に広く使用されます。
完全に新しい薬物の特性を理解して、齧歯動物の生体内で実験を行うことが不可欠です。しかし、この従来の方法は高価で時間がかかるです。近年、ゼブラフィッシュ (動脈分布) が安くかつ迅速に高めるために広く研究所生物になった。ゼブラフィッシュ表す 3 D セル文化アプローチ、9の脊椎動物の体内の設定の中で腫瘍を開発しました。
完全に、我々 はここで使用 Cfa、SFAs ゼブラフィッシュ生体内で腫瘍形成など 3 つの異なる 3 D 文化アプローチ BH3 模倣との組み合わせで肺がんがん A549 細胞モデルによる hydroxycoumarin OT48 の抗がん能力を発揮します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials required for colony formation assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>37 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>30096</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1520-500</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70075</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>Tube-170-C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Hyundai Micro</td>
			<td>H20015</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30012</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethoCult</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>4230</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5622</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS4000</td>
			<td>GE Healthcare Technologies</td>
			<td></td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials required for spheroid formation assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>37 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>30096</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1520-500</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70075</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3474</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials required for zebrafish xenografts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>37 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>30096</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1520-500</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T25</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70025</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>SPL</td>
			<td>70075</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T175</td>
			<td>SPL</td>
			<td>71175</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml tube</td>
			<td>Extragene</td>
			<td>Tube-170-C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30024</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>10100</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.02</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td>4 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71382</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2773</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7001</td>
			<td>-20 C&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW 100F-4</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter instrument, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>KOVAX</td>
			<td>1ml</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>HSU-1000612</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DE/DM 5000B</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical assessment of the bioactivity of the anticancer coumarin ot48 by spheroids, colony formation assays, and zebrafish xenografts

新規治療薬のin vitroとin vivoの前臨床スクリーニングは、がん創薬における重要なツールです。ひと癌細胞株は、2 D (二次元) 単層細胞培養治療化合物に対応がもっと生理学的に関連するモデルの薬剤の有効性を理解する 3 D 培養システムが開発されました。近年、パラダイム シフトは、3次元培養システム、腫瘍微小環境をより正確に模倣の新規分子の効力を検証するための前臨床研究で観察されました。これらのシステムはもっと生理学的に関連する方法で病気の状態を特徴付けるし、より良い機械論的洞察力と与えられた分子の薬理学的力の理解を得るを助けます。また、生体内で癌モデルの改良で現在の傾向とゼブラフィッシュは、生体内で腫瘍形成を評価し、治療薬の効果を研究する重要な脊椎動物モデルとして浮上しています。ここでは、調べた hydroxycoumarin OT48 の治療効果単独または肺がん細胞株 A549 BH3 オノマトペとの組み合わせでコロニー形成アッセイ (CFA)、スフェロイド形成アッセイ (SFA) を含む 3 つの異なる 3次元培養システムを用いた、ゼブラフィッシュ異種生体内で。

図 2肺癌細胞株 A549 でシードだった MCBM コロニーを形成する OT48 治療後単独で、または指定された濃度で綴じられた BH3 擬態 A1210477 との組み合わせでの。その結果、組み合わせを大幅に削減数、サイズおよび植民地の総面積 10 日間の培養後。
図 3、A549 細胞 BH3 擬態 A1210477 と OT4...

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Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

回転楕円体、コロニー形成アッセイとゼブラフィッシュ異種移植片による抗癌性クマリン OT48 の生物活性の臨床評価

三次元培養とゼブラフィッシュを用いた抗癌剤のクマリンの前臨床スクリーニングを紹介します。

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Research

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超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

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