Name: generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, octroyer le numéro CLANCY14XX0 et par le biais de la Fondation de la fibrose kystique, octroyer le numéro CLANCY15R0. Les auteurs tiennent à remercier Kristina Ray pour son aide dans le recrutement de patients et de la surveillance réglementaire. Les auteurs tiennent également à remercier le groupe de travail HNE, soutenu par la Fondation de la fibrose kystique, qui ont aidé à la génération des capacités de culture HNE : Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomon Marty et Katherine Tuggle.

Échantillons de l’HNE ont été achetés auprès de sujets recrutés par le Cincinnati Children Hospital Medical Center CF Research Center. Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Institutional Review Board (IRB) de Cincinnati Children Hospital Medical Center. Consentement a été obtenu de tous les sujets avant le test.
1. préparer les médias de l’Expansion et antibiotiques
<ol><li>Rassembler les composantes médias énumérés au tableau 1. D...

<ol>
	<li>Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li><li>Anderson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoside+triphosphates+are+required+to+open+the+CFTR+chloride+channel.">Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel.</a> Cell. 67 (4), 775-784 (1991).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+ion+transport.+Part+one.">Human airway ion transport. Part one.</a> Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+an+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).</li><li>Accurso, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+VX-770+in+persons+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D-CFTR+mutation.">Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation.</a> N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li><li>De Boeck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+a+non-G551D+gating+mutation.">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation.</a> J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).</li><li>Moss, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+who+have+an+Arg117His-CFTR+mutation:+a+double-blind,+randomised+controlled+trial.">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial.</a> Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. , (2015).</li><li>Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor+alone+and+combined+with+ivacaftor:+preclinical+and+clinical+trial+experience+of+F508del+CFTR+correction.">Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction.</a> Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CFTR2 Database. , (2017).</li><li>Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+for+cystic+fibrosis:+establishing+human+model+systems.">Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems.</a> Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).</li><li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research.">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).</li><li>Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biphasic+chamber+system+for+maintaining+polarity+of+differentiation+of+cultured+respiratory+tract+epithelial+cells.">A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).</li><li>Worthington, E. N., Tarran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+ASL+measurements+and+mucus+transport+rates+in+cell+cultures.">Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).</li><li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+the+F508del-CFTR+protein+processing+defect+in+vitro+by+the+investigational+drug+VX-809.">Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).</li><li>Hug, M. J., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurements+to+diagnose+cystic+fibrosis.">Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis.</a> J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).</li><li>van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+biochemical+analysis+of+CFTR+in+human+rectal+biopsies.">Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies.</a> Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids.">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).</li><li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+modulators+in+human+plasma.">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li><li>Zomer-van Ommen, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+premature+termination+codon+suppression+by+read-through+agents+in+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids.</a> J Cyst Fibros. , (2015).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).</li><li>Di Lullo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+&amp;#34;ex+vivo+model&amp;#34;+contributing+to+the+diagnosis+and+evaluation+of+new+drugs+in+cystic+fibrosis.">An &amp;#34;ex vivo model&amp;#34; contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis.</a> Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Devalia, J. L., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+in+culture:+an+overview+of+their+characteristics+and+function.">Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function.</a> Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>Thavagnanam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+can+act+as+a+physiological+surrogate+for+paediatric+asthma+studies.">Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies.</a> PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).</li><li>Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preservation+and+regeneration+of+cilia+on+human+nasal+epithelial+cells+cultured+in+vitro.">The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro.</a> Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> J Cyst Fibros. , (2017).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tgf-beta+downregulation+of+distinct+chloride+channels+in+cystic+fibrosis-affected+epithelia.">Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia.</a> PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+airway+surface+dehydration+as+the+initiating+event+in+CF+airway+disease.">Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease.</a> J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).</li></ol>

Ce protocole décrit la génération dérivé de patient nasal sphéroïde de cultures de cellules capables de produire un modèle de fonction CFTR individualisé, spécifique. Il y a plusieurs étapes clés dans le processus qui doit être étroitement assisté pour éviter les difficultés. Tout d’abord est une acquisition bon échantillon du nez du patient. Doit avoir un bon échantillon > 50 000 cellules, limitée glaire/débris et être prêt pour le traitement de moins de 4 h (même si le succès est aussi facile...

Fibrose kystique (FK) est une maladie récessive autosomique fatale affectant plus de 70.000 personnes dans le monde1. Cette maladie génétique de la vie-raccourcissement est dû à des mutations la Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) de protéines2. CFTR est membre de la famille de triphosphate d’adénosine-binding cassette et fonctions comme un canal ionique permettant le mouvement du chlorure et du bicarbonate à travers les membranes apicales de l’épithélium polarisé multiples, y compris le tube digestif, glandes sudoripares, respiratoire et des arbres, entre autres3,4. À ce titre, dysfonctionnelle CFTR entraîne multisystémique dysfonction épithéliale, avec la mortalité découlant de la maladie respiratoire1. Dans le poumon CF, perte du CFTR-conduit des voies respiratoires surface liquide (ASL) Règlement et du mucus libération conduit à mucus épaissi, obstruction des voies respiratoires, infection chronique et remodelage des voies aériennes progressive et poumon fonction1,5.
Malgré l’identification des dysfonctionnement CFTR comme étant la cause de la maladie, thérapies dans FC traditionnellement concentré sur l’atténuation des symptômes (par exemple, thérapie de remplacement d’enzymes pancréatiques, thérapies de dégagement des voies respiratoires)1. Cette approche a été récemment révolutionnée par l’apparition de nouveaux médicaments, appelés « Modulateurs CFTR, » qui ciblent directement dysfonctionnelle CFTR. Cette approche a changé le paysage clinique de gestion des symptômes de modificateurs de la maladie en charge, mais comporte plusieurs limites6,7,8,9,10. Activité de modulateur est spécifique à la défectuosité de la protéine qui accompagne chaque mutation CFTR et limité à sélectionner en génétique des populations,11. Cette limitation est entraînée par l’hétérogénéité des défauts de la protéine, mais aussi par l’impraticabilité des essais cliniques dans les groupes de mutation rare. En outre, chez les sujets présentant des génotypes bien étudiés (par exemple, F508del/F508del CFTR, la mutation CFTR la plus courante), il est grande variabilité en maladie fardeau et modulateur réponse6,7,8 ,9,11.
Pour résoudre ces deux problèmes, les chercheurs ont proposé l’utilisation de modèles personnalisés pour les essais précliniques12. Ce concept utilise des tissus spécifiques au patient pour générer un système de modèle individualisé ex vivo pour les essais en enclos, prédiction en vivo sujet réaction aux traitements de façon personnalisée. Une fois validé, un tel modèle pourrait servir par les cliniciens à la thérapie de précision lecteur quel que soit le génotype CFTR sous-jacent du patient.
Humaine (HBE) les cellules épithéliales bronchiques provenant du tissu de l’explant au moment de la transplantation pulmonaire a créé la possibilité d’un tel modèle pour CF13,14. HBEs cultivées à l’interface air-liquide (ALI) permettant de quantification fonctionnelle de CFTR directement par des tests électrophysiologiques, ou indirectement par le biais de mesures d’ASL homéostasie13,15. Ce modèle a été essentiels à la compréhension de la biologie CFTR et a été un facteur clé dans le développement de CFTR modulateurs16. Malheureusement, les modèles d’HBE ne sont pas tenable comme un modèle personnalisé en raison de la nature invasive de l’acquisition (transplantation pulmonaire ou brossage bronchique) et des échantillons pour ceux qui ont des mutations rares ou maladie bénigne. À l’inverse, tissu intestinal, obtenu à partir des spécimens de biopsie rectale ou duodénal, peut être utilisé pour la mesure de courant intestinale (ICM) ou une analyse axée sur l’enflure organoïde pour étude individualisée CFTR fonction17,18, 19. organoïde essais, en particulier, sont des modèles très sensibles du CFTR activité20,21,22. Les deux modèles sont limités par la source de tissu (tissu intestinal, tandis que la plupart pathologie de la maladie est respiratoire) et la méthode semi-invasive de l’acquisition. Par ailleurs, plusieurs chercheurs ont étudié nasale (HNE) les cellules épithéliales humaines au modèle CFTR restauration23,24,25. HNEs peuvent être récoltées en toute sécurité au pinceau ou curetage chez les sujets de tout âge et, lorsqu’il est cultivé dans la région ALI, récapituler beaucoup de caractéristiques de HBEs25,26,27,28. Des cultures monocouches HNE ont traditionnellement été limités par transformation squameuse et beaucoup de temps à maturité29. En outre, indiqué de court-circuit mesurer le courant dans HNEs est plus petits que ceux de HBEs, suggérant une petite fenêtre pour détecter l’efficacité thérapeutique25.
Compte tenu de la nécessité d’un modèle de culture de tissus personnalisés, non invasif, respiratoire de fonction CFTR, nous avons cherché à fusionner la sensibilité d’un gonflement, organoïde test avec le caractère non invasif et respiratoire de HNEs. Nous décrivons ici, notre méthode de production de cultures 3 dimensions « sphéroïde » de HNEs pour étude individualisée de CFTR dans un essai gonflement30. Sphéroïdes HNE polarisent de manière fiable avec l’apex épithélial vers le centre de la sphère, ou lumen. Ce modèle reprend de nombreuses caractéristiques d’un épithélium respiratoire inférieur et arrive à maturité plus rapidement que les cultures d’ALI. Comme un test fonctionnel, sphéroïdes HNE quantifient fiablement une fonction plage de CFTR, mais aussi modulation dans les groupes de mutation bien étudiés (par exemple, F508del CFTR). Cette analyse axée sur l’enflure capitalise sur les propriétés de transport des ions/sel de CFTR, mesurer indirectement afflux fluide dans l’ellipsoïde comme l’eau suit l’efflux sel apicale. De cette façon, des sphéroïdes stimulées avec CFTR entièrement fonctionnel gonflent robuste, tandis que ceux avec dysfonctionnelle CFTR moins gonflent ou rétrécissement. C’est quantifiée par analyse d’image des prébiotiques et sphéroïdes de stimulation après 1 h, zone luminale de mesure et de déterminer le pourcentage de changement. Cette mesure peut alors être comparée à travers des groupes expérimentaux à l’écran pour la bioactivité de la drogue de façon spécifique au patient.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="633">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">1.5 mL Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:149px;">USA Scientific&#160;</td>
			<td style="width:131px;">4036-3204</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">150 mL Filter Flask</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">TP99150</td>
			<td style="width:173px;">To filter Media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">15 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">TP91015</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">1 L Filter Flask</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">TP99950</td>
			<td style="width:173px;">To filter Media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">35 mm Glass-Bottom Dish</td>
			<td style="width:149px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:131px;">P35G-0-20-C</td>
			<td style="width:173px;">Optional</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:131px;">AC228420010&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">50 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">&#160;TP91050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Accutase</td>
			<td style="width:149px;">Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">AT-104</td>
			<td style="width:173px;">Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Adenine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A2786-25G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A9528-100MG</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Bovine Brain Extract (9mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Lonza&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CC-4098</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Ceftazidime hydrate</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C3809-1G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Cell Scrapers 20 cm&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">TP99010</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">CFTR Inh172</td>
			<td style="width:149px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:131px;">3430</td>
			<td style="width:173px;">Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C8052-.5MG</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">CYB-1</td>
			<td style="width:149px;">Medical Packaging Corporation</td>
			<td style="width:131px;">CYB-1</td>
			<td style="width:173px;">Cytology brush</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D5879-500ML</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11330-057</td>
			<td style="width:173px;">Base Medium; See Tables 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:180px;">Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free)</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">PHG6045</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Epinephrine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E4250-1G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Ethanol</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:131px;">2701</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E0135-500ML</td>
			<td style="width:173px;">16.6 mM solution; See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:149px;">TCI America&#160;</td>
			<td style="width:131px;">E0084</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Fetal Bovine Serum (high performance FBS)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">10082147</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">Forskolin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">F6886-50</td>
			<td style="width:173px;">Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:180px;">Growth Factor-Reduced Matrigel</td>
			<td style="width:149px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">356231</td>
			<td style="width:173px;">Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1483</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Advanced BioMatrix</td>
			<td style="width:131px;">5007-A</td>
			<td style="width:173px;">Collagen solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">HyClone (aka FetalClone II)&#160;</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare&#160;</td>
			<td style="width:131px;">SH30066.03HI</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:131px;">07904</td>
			<td style="width:173px;">See Tables 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Insulin, human recombinant, zinc solution</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:131px;">12585014</td>
			<td style="width:173px;">4 mg/mL solution; see Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">IVF 4-Well Dish, Non-treated</td>
			<td style="width:149px;">NUNC (via Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:131px;">12566350</td>
			<td style="width:173px;">4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">MEF-CF1-IRR</td>
			<td style="width:149px;">Globalstem</td>
			<td style="width:131px;">GSC-6001G</td>
			<td style="width:173px;">Irradiated murine embryonic fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:180px;">Metamorph 7.7</td>
			<td style="width:149px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;">Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:180px;">Olympus IX51 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:149px;">Olympus Corporation</td>
			<td style="width:131px;">Discontinued</td>
			<td style="width:173px;">Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&#160; for a quote</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:131px;">15140122</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Phsophoryletheanolamine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P0503-5G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Retinoic Acid</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Rhinoprobe</td>
			<td style="width:149px;">Arlington Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">96-0905</td>
			<td style="width:173px;">Nasal curette</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:180px;">Slidebook 5.5</td>
			<td style="width:149px;">3i, Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:131px;">Discontinued</td>
			<td style="width:173px;">Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">20012050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">W3500-6X500ML</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Tissue Culture Dish 100</td>
			<td style="width:149px;">Techno Plastic Products</td>
			<td style="width:131px;">93100</td>
			<td style="width:173px;">Tissue culture dish for expansion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Tobramycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T4014-100MG</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Lonza&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CC-4205</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">Triiodothryonine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T6397-1G</td>
			<td style="width:173px;">3,3&#8242;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt&#160; [T3]; See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Trypsin from Porcine Pancreas</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T4799-10G</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Ultroser-G</td>
			<td style="width:149px;">Crescent Chemical (via Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:131px;">NC0393024</td>
			<td style="width:173px;">20 mL lypophilized powder; See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">V2002-5G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">VX770</td>
			<td style="width:149px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">S1144</td>
			<td style="width:173px;">Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">VX809</td>
			<td style="width:149px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">S1565</td>
			<td style="width:173px;">Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:180px;">Y-27632 Dihydrochloride&#160; ROCK inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Enzo LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:131px;">ALX-270-333-M025&#160;</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study

Alors que l’introduction de médicaments modulateur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) a révolutionné les soins dans la fibrose kystique (FK), le modèle de thérapie axée sur le génotype en cours d’utilisation présente plusieurs limites. Groupes de mutation premier, rares ou peu étudiée sont exclus des essais cliniques définitives. En outre, comme drogues de modulateur supplémentaires entrer sur le marché, il deviendra difficile d’optimiser les choix de modulateur pour un sujet individuel. Ces deux problèmes sont abordés avec l’utilisation de systèmes individualisés, dérivé de patient modèle préclinique de fonction CFTR et modulation. Cellules épithéliales nasales humaines (HNEs) constituent une source facilement accessible du tissu respiratoire pour un tel modèle. Ici, nous décrivons la génération d’un modèle tridimensionnel sphéroïde de fonction CFTR et modulation en utilisant HNEs primaires. HNEs sont isolés des sujets de façon mini-invasive, élargi dans les conditions de reprogrammation conditionnelles et ensemencé dans la culture de l’ellipsoïde. Dans les 2 semaines des semis, cultures de sphéroïde génèrent des sphéroïdes HNE qui peuvent être stimulés avec 3', 5'-l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc)-générer des agonistes pour activer la fonction CFTR. Gonflement de sphéroïde est ensuite quantifié comme indicateur d’activité CFTR. Sphéroïdes HNE capitaliser sur l’origine peu invasive, mais respiratoire de cellules nasales pour générer un modèle accessible, personnalisé, pertinent à un épithélium reflétant la mortalité et la morbidité de la maladie. Par rapport aux cultures HNE interface air-liquide, sphéroïdes sont relativement rapides à maturité, ce qui réduit le taux global de contamination. Dans sa forme actuelle, le modèle est limité par un débit faible, mais cela est compensé par la facilité d’acquisition de tissu. Sphéroïdes HNE permet de quantifier et de caractériser l’activité CFTR au niveau individuel de façon fiable. Une étude en cours de lier cette quantification à in vivo la réaction aux médicaments déterminera si les sphéroïdes HNE sont un vrai prédicteur préclinique de la réponse du patient à la modulation de CFTR.

HNEs devrait fixer à la boîte de Petri et forment des îlots de cellules dans les 72 h d’ensemencement ; exemples de formation de l’île de bonne et mauvaise à une semaine sont présentés dans la Figure 1bis et 1 b, respectivement. Ces îles doivent se développer pour couvrir le plat au cours de 15 à 30 jours. Petits ou sous-optimal des échantillons peuvent prendre plus de temps et souvent ne donneront pas utiles sphéroïdes. Con...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study at JoVE.com

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Nous décrivons ici une méthode pour générer des cultures sphéroïde en trois dimensions des cellules épithéliales nasales humaines. Sphéroïdes sont alors stimulés au lecteur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-ion charge et sécrétion de liquide, quantifier le changement de la taille de luminal sphéroïde comme approximation de fonction CFTR.

Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Génération expérimentale de carcinome Associated fibroblastes (CAF) à partir des fibroblastes mammaires

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Recherche

Médecine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Using Continuous Data Tracking Technology to Study Exercise Adherence in Pulmonary Rehabilitation

Utilisation de la technologie de suivi en continu des données pour étudier exercice adhésion en réadaptation pulmonaire

Pulmonary rehabilitation (PR) is an important component in the management of respiratory diseases. The effectiveness of PR is dependent upon adherence to ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture pour l&#39;étude de myofibroblastes et de matrice extracellulaire Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

Un plexus choroïde épithéliale Modèle base de cellules de la barrière Fluid Human Blood-céphalo-rachidien pour étudier l&#39;infection bactérienne du côté basolatéral

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Normalisée de mesure de différence de potentiel transépithélial Membrane nasale (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

La génération des Fractures fémorales fermées chez la souris : un modèle pour étudier la guérison osseuse

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...