Name: generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela terapêutica de fundação de fibrose cística, conceder número CLANCY14XX0 e através da Fundação de fibrose cística, conceder o número CLANCY15R0. Os autores desejam agradecer a Kristina Ray pela sua assistência no recrutamento de paciente e fiscalização regulamentar. Os autores também desejam agradecer ao grupo de trabalho HNE, apoiado pela Fundação de fibrose cística, que ajudou na geração de recursos de cultura HNE: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomão Marty e Katherine Tuggle.

Amostras HNE foram obtidas de indivíduos recrutados através de Hospital Medical Center CF Research Center Cincinnati infantil. Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por institucional Review Board (IRB), do Hospital Medical Center infantil de Cincinnati. Obteve-se consentimento escrito de todos os indivíduos antes do teste.
1. prepare a expansão Media e Media antibiótico
<ol><li>Reunir os componentes de mídia listados na tabela 1. Descongelar materiais congel...

<ol>
	<li>Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li><li>Anderson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoside+triphosphates+are+required+to+open+the+CFTR+chloride+channel.">Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel.</a> Cell. 67 (4), 775-784 (1991).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+ion+transport.+Part+one.">Human airway ion transport. Part one.</a> Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+an+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).</li><li>Accurso, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+VX-770+in+persons+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D-CFTR+mutation.">Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation.</a> N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li><li>De Boeck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+a+non-G551D+gating+mutation.">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation.</a> J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).</li><li>Moss, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+who+have+an+Arg117His-CFTR+mutation:+a+double-blind,+randomised+controlled+trial.">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial.</a> Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. , (2015).</li><li>Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor+alone+and+combined+with+ivacaftor:+preclinical+and+clinical+trial+experience+of+F508del+CFTR+correction.">Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction.</a> Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CFTR2 Database. , (2017).</li><li>Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+for+cystic+fibrosis:+establishing+human+model+systems.">Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems.</a> Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).</li><li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research.">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).</li><li>Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biphasic+chamber+system+for+maintaining+polarity+of+differentiation+of+cultured+respiratory+tract+epithelial+cells.">A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).</li><li>Worthington, E. N., Tarran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+ASL+measurements+and+mucus+transport+rates+in+cell+cultures.">Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).</li><li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+the+F508del-CFTR+protein+processing+defect+in+vitro+by+the+investigational+drug+VX-809.">Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).</li><li>Hug, M. J., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurements+to+diagnose+cystic+fibrosis.">Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis.</a> J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).</li><li>van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+biochemical+analysis+of+CFTR+in+human+rectal+biopsies.">Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies.</a> Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids.">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).</li><li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+modulators+in+human+plasma.">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li><li>Zomer-van Ommen, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+premature+termination+codon+suppression+by+read-through+agents+in+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids.</a> J Cyst Fibros. , (2015).</li><li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure.">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).</li><li>Di Lullo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+&amp;#34;ex+vivo+model&amp;#34;+contributing+to+the+diagnosis+and+evaluation+of+new+drugs+in+cystic+fibrosis.">An &amp;#34;ex vivo model&amp;#34; contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis.</a> Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Devalia, J. L., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+in+culture:+an+overview+of+their+characteristics+and+function.">Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function.</a> Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>Thavagnanam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+can+act+as+a+physiological+surrogate+for+paediatric+asthma+studies.">Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies.</a> PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).</li><li>Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preservation+and+regeneration+of+cilia+on+human+nasal+epithelial+cells+cultured+in+vitro.">The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro.</a> Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids.">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> J Cyst Fibros. , (2017).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tgf-beta+downregulation+of+distinct+chloride+channels+in+cystic+fibrosis-affected+epithelia.">Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia.</a> PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+airway+surface+dehydration+as+the+initiating+event+in+CF+airway+disease.">Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease.</a> J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).</li></ol>

Este protocolo descreve a geração de culturas de esferoide de paciente-derivado nasal células capazes de produzir um modelo individualizado, específico da função CFTR. Existem várias etapas-chave no processo que deve ser atendido de perto para evitar a dificuldade. Primeiro é uma aquisição de boa amostra do nariz do paciente. Deve ter uma boa amostra > 50.000 células, limitada muco/detritos e estar pronto para processamento dentro de 4 h (apesar de sucesso também é facilmente alcançável com pernoite no gel...

Fibrose cística (CF) é uma doença fatal, autossômica recessiva, afetando mais de 70000 pessoas em todo o mundo1. Esta doença genética da vida-gordura é causada por mutações na condutância transmembranar de fibrose cística regulador proteína (CFTR)2. CFTR é um membro da família de gaveta de trifosfato de adenosina-ligação e funções como um canal iônico, permitindo a circulação de cloreto e bicarbonato através das membranas apicais de epitélios polarizadas múltiplos, incluindo o trato gastrointestinal, glândulas sudoríparas, respiratória e árvore, entre outros3,4. Como tal, disfuncional CFTR leva à disfunção epitelial multissistêmica, com maior mortalidade decorrente da doença respiratória1. No pulmão CF, perda do CFTR-conduzido as vias aéreas superfície líquida (ASL) regulamento e muco lançamento leva ao muco espessado, obstrução das vias aéreas, infecção crônica e remodelação progressiva das vias respiratórias e perda de função de pulmão1,5.
Apesar da identificação de disfunção CFTR como a causa da doença, terapias em CF tradicionalmente focada na atenuação dos sintomas (por exemplo, terapia de reposição de enzimas pancreáticas, terapias de limpeza das vias respiratórias)1. Esta abordagem foi revolucionada recentemente pelo advento da novela terapêutica, denominado "Moduladores CFTR," que destino diretamente CFTR disfuncional. Esta abordagem mudou a paisagem clínica de gestão sintoma para doença-modificando conta mas carrega várias limitações6,7,8,9,10. Atividade do modulador é específico para o defeito de proteína que acompanham cada mutação CFTR e limitada para selecionar populações genéticas11. Essa limitação é impulsionada pela natureza heterogênea dos defeitos de proteína, mas também pelo impracticality de ensaios clínicos em grupos de rara mutação. Além disso, entre indivíduos com genótipos estudados (por exemplo, F508del/F508del CFTR, o mais comum mutação CFTR), há grande variabilidade na doença fardo e modulador resposta6,7,8 ,9,11.
Para superar esses dois problemas, os investigadores propuseram o uso de modelos personalizados para testes pré-clínicos12. Este conceito utiliza tecido do paciente específico para gerar um sistema individualizado ex vivo modelo para testes de compostos, prevendo na vivo resposta assunto para terapias de forma personalizada. Uma vez validado, tal modelo poderia ser usado por médicos para terapia de precisão unidade independentemente do genótipo CFTR subjacente do paciente.
Brônquico epitelial (HBE) as células humanas obtidas de explant tecido no momento do transplante de pulmão estabeleceram a possibilidade de tal modelo para CF13,14. HBEs crescidos em uma interface ar-líquido (ALI) permitem a quantificação de CFTR funcional diretamente por meio de testes eletrofisiológicos, ou indiretamente através de medidas de ASL homeostase13,15. Este modelo tem sido fundamental para a compreensão de biologia CFTR e foi um impulsionador essencial no desenvolvimento do CFTR moduladores16. Infelizmente, HBE modelos não são defensáveis como um modelo personalizado devido a natureza invasiva da aquisição (transplante de pulmão ou escovagem brônquica) e falta de amostras para aqueles com mutações raras ou doença leve. Por outro lado, tecido intestinal, obtido a partir de espécimes de biópsia retal ou duodenal, pode ser usado para medição de corrente intestinal (ICM) ou um ensaio baseado em inchaço organoides para estudo individualizado CFTR função17,18, 19. ensaios de organoides, em particular, são modelos muito sensíveis de CFTR atividade20,21,22. Ambos os modelos são limitados pela fonte de tecido (tecido intestinal, enquanto a maioria das doenças de patologia é respiratória) e o método semi-invasivo de aquisição. Como alternativa, vários investigadores estudaram nasal epitelial (HNE) as células humanas para modelo CFTR restauração23,24,25. HNEs podem com segurança ser colhidas pelo pincel ou curetagem em indivíduos de qualquer idade e, quando cultivadas em ALI, recapitular muitas características da HBEs25,26,,27,28. Culturas de monocamada HNE tradicionalmente tem sido limitadas pela transformação escamosa e há muito tempo a maturidade29. Além disso, relatou um curto-circuito atuais medições em HNEs são menores do que aqueles em HBEs, sugerindo uma janela menor para detectar a eficácia terapêutica25.
Dada a necessidade de um modelo de cultura de tecidos personalizados, não-invasivo, respiratória da função CFTR, procuramos mesclar a sensibilidade de um ensaio de organoides inchaço-baseado, com carácter invasivo e respiratória da HNEs. Aqui, descrevemos o nosso método de gerar culturas "esferoide" 3-dimensional da HNEs para estudo individualizado de CFTR em um ensaio baseado em inchaço30. Esferoides HNE polarizar confiantemente com o ápice epitelial para o centro da esfera, ou o lúmen. Este modelo recapitula a numerosas características de um epitélio respiratório inferior e amadurece mais rapidamente do que as culturas ALI. Como um ensaio funcional, esferoides HNE confiantemente quantificam uma gama de CFTR função, bem como a modulação em grupos de mutação estudada (por exemplo, F508del CFTR). Este ensaio baseado em inchaço capitaliza sobre as propriedades de transporte de íon/sal de CFTR, indiretamente, medindo influxo de fluidos para o spheroid como água segue apical efluxo de sal. Desta forma, esferoides estimuladas com CFTR funcional incham robustamente, enquanto aqueles com CFTR disfuncional menos incham ou encolhem. Isto é quantificado através de análise de imagens de pré e esferoides pós-estimulação de 1 h, medindo a área luminal e determinar a porcentagem mudam. Esta medida pode ser comparada em seguida através de grupos experimentais para triagem de bioatividade de drogas de forma paciente específico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="633">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">1.5 mL Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:149px;">USA Scientific&#160;</td>
			<td style="width:131px;">4036-3204</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">150 mL Filter Flask</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">TP99150</td>
			<td style="width:173px;">To filter Media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">15 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">TP91015</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">1 L Filter Flask</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">TP99950</td>
			<td style="width:173px;">To filter Media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">35 mm Glass-Bottom Dish</td>
			<td style="width:149px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:131px;">P35G-0-20-C</td>
			<td style="width:173px;">Optional</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:131px;">AC228420010&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">50 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">&#160;TP91050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Accutase</td>
			<td style="width:149px;">Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">AT-104</td>
			<td style="width:173px;">Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Adenine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A2786-25G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A9528-100MG</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Bovine Brain Extract (9mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Lonza&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CC-4098</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Ceftazidime hydrate</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C3809-1G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Cell Scrapers 20 cm&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Midsci&#160;</td>
			<td style="width:131px;">TP99010</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">CFTR Inh172</td>
			<td style="width:149px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:131px;">3430</td>
			<td style="width:173px;">Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C8052-.5MG</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">CYB-1</td>
			<td style="width:149px;">Medical Packaging Corporation</td>
			<td style="width:131px;">CYB-1</td>
			<td style="width:173px;">Cytology brush</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D5879-500ML</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11330-057</td>
			<td style="width:173px;">Base Medium; See Tables 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:180px;">Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free)</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">PHG6045</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Epinephrine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E4250-1G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Ethanol</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:131px;">2701</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">E0135-500ML</td>
			<td style="width:173px;">16.6 mM solution; See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:149px;">TCI America&#160;</td>
			<td style="width:131px;">E0084</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Fetal Bovine Serum (high performance FBS)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:131px;">10082147</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">Forskolin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">F6886-50</td>
			<td style="width:173px;">Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:180px;">Growth Factor-Reduced Matrigel</td>
			<td style="width:149px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">356231</td>
			<td style="width:173px;">Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:149px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1483</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Advanced BioMatrix</td>
			<td style="width:131px;">5007-A</td>
			<td style="width:173px;">Collagen solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">HyClone (aka FetalClone II)&#160;</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare&#160;</td>
			<td style="width:131px;">SH30066.03HI</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:131px;">07904</td>
			<td style="width:173px;">See Tables 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Insulin, human recombinant, zinc solution</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:131px;">12585014</td>
			<td style="width:173px;">4 mg/mL solution; see Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">IVF 4-Well Dish, Non-treated</td>
			<td style="width:149px;">NUNC (via Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:131px;">12566350</td>
			<td style="width:173px;">4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">MEF-CF1-IRR</td>
			<td style="width:149px;">Globalstem</td>
			<td style="width:131px;">GSC-6001G</td>
			<td style="width:173px;">Irradiated murine embryonic fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:180px;">Metamorph 7.7</td>
			<td style="width:149px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;">Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:180px;">Olympus IX51 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:149px;">Olympus Corporation</td>
			<td style="width:131px;">Discontinued</td>
			<td style="width:173px;">Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&#160; for a quote</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:131px;">15140122</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Phsophoryletheanolamine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P0503-5G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Retinoic Acid</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Rhinoprobe</td>
			<td style="width:149px;">Arlington Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">96-0905</td>
			<td style="width:173px;">Nasal curette</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:180px;">Slidebook 5.5</td>
			<td style="width:149px;">3i, Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:131px;">Discontinued</td>
			<td style="width:173px;">Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">20012050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">W3500-6X500ML</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Tissue Culture Dish 100</td>
			<td style="width:149px;">Techno Plastic Products</td>
			<td style="width:131px;">93100</td>
			<td style="width:173px;">Tissue culture dish for expansion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:180px;">Tobramycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T4014-100MG</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Lonza&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CC-4205</td>
			<td style="width:173px;">See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">Triiodothryonine</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T6397-1G</td>
			<td style="width:173px;">3,3&#8242;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt&#160; [T3]; See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Trypsin from Porcine Pancreas</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T4799-10G</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:180px;">Ultroser-G</td>
			<td style="width:149px;">Crescent Chemical (via Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:131px;">NC0393024</td>
			<td style="width:173px;">20 mL lypophilized powder; See Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">V2002-5G</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">VX770</td>
			<td style="width:149px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">S1144</td>
			<td style="width:173px;">Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:180px;">VX809</td>
			<td style="width:149px;">Selleck Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">S1565</td>
			<td style="width:173px;">Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:180px;">Y-27632 Dihydrochloride&#160; ROCK inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Enzo LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:131px;">ALX-270-333-M025&#160;</td>
			<td style="width:173px;">See Table 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study

Enquanto a introdução de medicamentos de modulador de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) revolucionou a cuidados na fibrose cística (CF), o modelo de terapia genótipo-dirigido, atualmente em uso tem várias limitações. Grupos de primeira, raro ou pouco estudado de mutação são excluídos dos ensaios clínicos definitivos. Além disso, como drogas adicionais modulador entrarem no mercado, ele se tornará difícil de otimizar as escolhas de modulador para um sujeito individual. Estas duas questões são tratadas com o uso de sistemas de paciente-derivado, individualizado pré-clínicos modelo de função CFTR e modulação. Células epiteliais nasais humanas (HNEs) são uma fonte facilmente acessível de tecido respiratório para esse modelo. Aqui, descrevemos a geração de um modelo tridimensional esferoide de função CFTR e modulação usando HNEs primários. HNEs são isolados de indivíduos de uma forma minimamente invasiva, expandiu-se em condições de reprogramação condicionais e semeado na cultura esferoide. Dentro de duas semanas de semeadura, culturas de esferoide geram esferoides HNE que podem ser estimulados com 3', 5'-cíclico adenosina monofosfato (cAMP)-gerando agonistas para ativar a função CFTR. Inchaço de esferoide é então quantificado como um proxy de atividade CFTR. Esferoides HNE capitalizar a origem minimamente invasiva, mas respiratória das células nasais para gerar um modelo acessível e personalizado relevante para um epitélio refletindo a mortalidade e a morbidade da doença. Em comparação com as culturas HNE interface ar-líquido, esferoides são relativamente rápidas amadurecer, que reduz a taxa de contaminação global. Na sua forma atual, o modelo é limitado pela baixa taxa de transferência, mas isso é compensado pela relativa facilidade de aquisição de tecido. Esferoides HNE podem ser usados para confiantemente quantificar e caracterizar a atividade CFTR no nível individual. Um estudo em curso para amarrar esta quantificação na vivo resposta droga irá determinar se esferoides HNE são verdadeiro pré-clínicos preditor de resposta do doente à modulação de CFTR.

HNEs deve anexar para o prato de cultura e formam pequenas ilhas de células dentro de 72 h de semeadura; exemplos de formação de ilha de bom e pobre em uma semana são mostrados na figura 1A e 1B, respectivamente. Estas ilhas devem expandir para cobrir o prato ao longo de 15-30 dias. Amostras de pequenas ou de qualidade inferior podem levar mais tempo e muitas vezes não renderá esferoides útil. Contaminação com agentes infecciosos é ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study at JoVE.com

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Aqui nós descrevemos um método para gerar culturas esferoide tridimensional de células epiteliais nasais humanas. Esferoides são então estimulados a unidade de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR)-íon dependente e secreção fluida, quantificar a mudança no tamanho luminal esferoide como um proxy para função CFTR.

Geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

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