Name: an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness at JoVE.com

लेखक एस वाई चोई (Chonnam राष्ट्रीय विश्वविद्यालय) बहुमूल्य टिप्पणियां और हमारी पांडुलिपि के गहन पढ़ने के लिए धंयवाद । इस काम को Chungnam नेशनल यूनिवर्सिटी के एक रिसर्च फंड ने सपोर्ट किया था ।

1. Transgene उपक्लोनिंग
<ol><li>pEUI (+) के MCS में एक उचित प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइट (या साइटों) का चयन करें, और वांछित दिशा में ब्याज की जीन उपक्लोन (चित्रा 1). नोट: EGFP या झंडा epitope-टैग ankyrin दोहराने डोमेन 13A (ANKRD...

<ol>
	<li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems.">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. 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P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse.">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li><li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide,+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist.">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li><li>McConnell, M. J., Imperiale, M. 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एक द्विआधारी जीन अभिव्यक्ति स्विच का उपयोग कर के मुख्य दोष एक साथ लक्ष्य कक्ष में दो अलग plasmids (चालक और प्रभाव) देने की जरूरत है । यह plasmids के एक असमान वितरण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और स्विच के एक असंगत ?...

कई विभिंन जीन स्विचेस को ठीक सेल संस्कृति और पशु मॉडल में transgene अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता के लिए पता लगाया गया है, सफलता1,2,3की डिग्री बदलती के साथ । संभावित जीन स्विच सिस्टम सहित कई कड़े मानदंडों को पूरा करना चाहिए,: transgene, खुराक के सटीक दिशात्मक अभिव्यक्ति और उत्प्रेरणों के लिए समय पर निर्भर जवाबदेही, प्रमोटर की नगण्य leakiness, transgene के reversibility उत्प्रेरण हटाने के माध्यम से सक्रियण, और सेल लाइनों और प्रयोगशाला जानवरों1,2,3के लिए संतोषजनक विषाक्तता का स्तर । टेट्रासाइक्लिन4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10, सहित कई छोटे अणु उत्प्रेरणों का शोषण किया गया है, और ecdysone11,12,13,14. सामान्य तौर पर, इन प्रणालियों दो या तीन असतत अभिव्यक्ति इकाइयों, जिनमें से एक या दो जिनमें से एक विनियामक तत्व (उत्प्रेरण प्लाज्मिड) है कि एक छोटे से अणु उत्प्रेरण transcriptional गतिविधि हासिल करने के लिए बांध के साथ दो plasmids की आवश्यकता होती है; और एक अंय प्लाज्मिड (प्रभाव प्लाज्मिड) एक विनियामक डीएनए क्षेत्र है कि उत्प्रेरण-बाध्य विनियामक तत्व के उपयोग की अनुमति देता है के नियंत्रण में युक्त transgene । द्विआधारी प्रणाली के मुख्य दोष यह है कि यह दो वैक्टर के सहवर्ती परिचय (उत्प्रेरण और प्रभाव) लक्ष्य कक्ष में की आवश्यकता है । क्षणिक transgene अभिव्यक्ति प्रयोगों में, दो plasmids के एक साथ अभिकर्मक अनिवार्य रूप से कोशिकाओं है कि अकेले या तो उत्प्रेरण या प्रभाव, या सह transfected असमान के साथ transfected है की आबादी पैदा करता है । इसके अतिरिक्त, बाइनरी प्रणाली में स्थिर कोशिका रेखाएं स्थापित करने के लिए एंटीबायोटिक के चयन के कम से दो दौर की आवश्यकता होती है, जो कि समय लेने वाली और श्रमसाध्य है । इस प्रकार, एक सदिश में transgene अभिव्यक्ति और विनियमन के लिए आवश्यक घटकों के सभी संयोजन एक ही कक्ष में सभी आवश्यक तत्वों की सहवर्ती अभिव्यक्ति की गारंटी और transgene अभिव्यक्ति के विनियमन के लिए अनुमति देने के लिए आदर्श होगा छोटे अणु उत्प्रेरण के साथ उपचार के माध्यम से ।
बाइनरी जीन स्विच की कमियों को दूर करने के लिए हमने हाल ही में एक विलक्षण जीन स्विच विकसित किया, जिसका उपयोग एक Drosophila melanogaster ईसीआर आधारित जीन inducible प्रणाली15ने किया । Ecdysone मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति जब यह ईसीआर/ultraspiracle (खासियत) heterodimer है, जो बारी में डीएनए विनियामक तत्वों के लिए ईसीआर के बंधन में लाती है3,11के लिए बाइंड कर देता है । हड्डीवाला रेटिनॉइड एक्स रिसेप्टर (RXR), कीट खासियत की एक ortholog, रंगरूटों ईसीआर एक सक्रिय transcriptional उत्प्रेरक16बनाने के लिए । इस प्रकार, हड्डीवाला कोशिकाओं या ऊतक, ईसीआर और RXR में एक transgene के लक्षित अभिव्यक्ति के लिए सह होना चाहिए पहले एक साथ व्यक्त ecdysone या उसके एगोनिस्ट द्वारा उत्तेजित किया जा रहा है । ईसीआर-आधारित जीन स्विच की heterodimeric सुविधा के बाद से अंतर्जात RXR स्तर, Padidam एट अलसे प्रभावित किया जा सकता है । ईसीआर डीएनए की जगह-heterologous GAL4 डीएनए के साथ बाध्यकारी और सक्रियकरण डोमेन-बाध्यकारी, दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रोटीन vmw65 (VP16) सक्रियकरण डोमेन ईसीआर ligand-बाध्यकारी डोमेन है, जो तो अंतर्जात RXR को निष्क्रिय हो गया और एक homodimer का गठन करने के लिए जुड़े transcriptional गतिविधि हासिल करने के लिए17. ईसीआर आधारित जीन स्विच और एक chimeric ंयूनतम VP16 सक्रियण GvEcR, जो एक homodimer और cytosol ecdysone, एगोनिस्ट16के अभाव में Teb में स्थानीयकृत गठन के साथ संयुक्त डोमेन के शामिल प्रोटीन के निर्माण से सुधार हुआ था, 18. Teb के लिए बाध्य करके, GvEcR नाभिक को cytosol से अपने उपसेलुलर स्थानीयकरण बदल एक संकर zebrafish E1b ंयूनतम प्रमोटर के शामिल एक दस मिलकर दोहराया ऊपर सक्रियकरण अनुक्रम (UASs) के साथ संयुक्त प्रमोटर को पहचानने के लिए शुरू लक्ष्य जीन की प्रतिलेखन16।
के लिए पहले रिपोर्ट ईसीआर आधारित सरल जीन स्विचेस16,18, हम एक एकल वेक्टर में transgene अभिव्यक्ति उत्तेजक के लिए सभी आवश्यक तत्वों के साथ सुसज्जित है, और फिर नामित प्रणाली के द्विआधारी सुविधाओं संयुक्त नव निर्मित वेक्टर, pEUI (+) (GenBank प्रवेश संख्या: KP123436, चित्र 1a)15। GvEcR चालक (इसके बाद चालक) को जवाब देने के प्रभाव दस मिलकर यूएएस एक E1b ंयूनतम प्रमोटर के बाद एक बहु क्लोनिंग साइट (MCS) के साथ EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, और AflII मांयता दृश्यों के लिए अगले दोहराता है (चित्र 1b) । इसके अतिरिक्त, transfected कोशिकाओं के चयन की सुविधा के लिए, एक SV40 प्रमोटर चालित puromycin एन-एसिटाइल-ट्रांस्फ़्रेज़ (पीएसी) जीन चालक और प्रभाव क्षेत्रों के बीच स्थिर सेल लाइनों (चित्रा 1) बनाए रखने के लिए रखा गया था ।
हम pEUI (+) का उपयोग कर transgene अभिव्यक्ति के क्षणिक और स्थिर मॉडुलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । इसके अलावा, हम एक ecdysone एगोनिस्ट के रूप में Teb के सफल प्रयोग के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEUI(+)</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The patent license was transferred to TransLab Inc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gene-Fect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;">TLC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tebufenozide</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">S001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:71px;">SPL life science</td>
			<td style="width:119px;">11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse FLAG M2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-alpha tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">CP06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td style="width:71px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740410.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M-PER Mammalian Protein 
			Extraction Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Protease inhibitor Cock. III</td>
			<td style="width:71px;">T&#38;I</td>
			<td style="width:119px;">BPI-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

transgene अभिव्यक्ति का सटीक नियंत्रण जैविक और नैदानिक अध्ययन में वांछनीय है । हालांकि, क्योंकि वर्तमान में कार्यरत जीन स्विच के द्विआधारी सुविधा दो चिकित्सीय अभिव्यक्ति इकाइयों के हस्तांतरण एक ही कक्ष में समवर्ती की आवश्यकता है, जीन थेरेपी के लिए प्रणाली के व्यावहारिक आवेदन सीमित है । transgene अभिव्यक्ति प्रणाली को सरल बनाने के लिए, हम एक जीन pEUI के रूप में निर्दिष्ट स्विच उत्पंन (+) transgene अभिव्यक्ति मॉड्यूल का एक पूरा सेट शामिल एक एकल सदिश में । GAL4 डीएनए के शामिल-बंधन डोमेन और संशोधित ईसीआर (GvEcR), एक ंयूनतम VP16 सक्रियकरण डोमेन एक GAL4 डीएनए के साथ जुड़े-बंधन डोमेन, साथ ही साथ एक संशोधित Drosophila ecdysone रिसेप्टर (ईसीआर), नव विकसित एकवचन जीन स्विच अत्यधिक है एक समय और खुराक पर निर्भर तरीके से एक रासायनिक उत्प्रेरण के प्रशासन के लिए उत्तरदायी. pEUI (+) वेक्टर दोनों जैविक अनुसंधान और पूर्व नैदानिक अध्ययन में transgene अभिव्यक्ति के नियंत्रण में सुधार के लिए एक संभावित शक्तिशाली उपकरण है । यहाँ, हम tebufenozide (Teb) के उपचार के द्वारा वेक्टर pEUI (+) का उपयोग कर एक क्षणिक और स्थिर transgene अभिव्यक्ति के मॉडुलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इसके अतिरिक्त, हम एक रासायनिक उत्प्रेरण के रूप में Teb के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण दिशानिर्देश साझा करते हैं ।

GvEcR आधारित एकवचन जीन स्विच को फिगर 1aमें दर्शाया गया है । pEUI (+) वेक्टर Teb के साथ उपचार द्वारा विनियमित transgene अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया था । pEUI के प्रभाव क्षेत्र (+) एक 10xUAS और एक E1b ंय...

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An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

एक Ecdysone रिसेप्टर-मजबूती, Reversibility, और नगण्य Leakiness के साथ Transgene की जानबूझकर अभिव्यक्ति के लिए विलक्षण जीन स्विच आधारित

यहाँ, हम tebufenozide उपचार द्वारा pEUI (+) एकवचन जीन स्विच का उपयोग transgene अभिव्यक्ति का मॉडुलन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

मानव प्राथमिक सेल संस्कृतियों में circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन के स्राव के समानांतर मापन

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

एकल कोशिका जीन एक्सप्रेशन मल्टीप्लेक्स RT-qPCR का उपयोग दुर्लभ Lymphoid आबादी की विविधता विशेषताएँ

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा आंतरिक मानकों के साथ FACS और qPCR का उपयोग

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

दो पूरक सेल तुल्यकालन प्रोटोकॉल द्वारा सेल चक्र-विनियमित जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करना

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

नमूना तैयारी और Zebrafish से RNASeq आधारित जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

C. एलिगेंस में व्यापक रेंज आहार प्रतिबंध के तहत आयु मॉडुलन के दौरान जीन अभिव्यक्ति के स्तर द्वारा इनकोडिंग जानकारी का ठहराव

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

जीन क्लोनिंग के बिना एक जीन-बाधित स्ट्रेप्टोकोकस mutans तनाव की पीढ़ी

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

वृद्धि का प्रवाह के साथ बमबारी जौ Aleurone परतों में जीन अभिव्यक्ति मापने

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

एक Optogenetic विधि को नियंत्रित करने और सेल में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने वाली सेल बातचीत

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

जड़ Microbiome की खोज: मिट्टी, Rhizosphere से बैक्टीरियल समुदाय डेटा निकालने, और जड़ Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...