Name: an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00
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Gli autori ringraziano S-Y Choi (Università nazionale di Chonnam) per i preziosi commenti e lettura approfondita del nostro manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un fondo di ricerca dell'Università nazionale di Chungnam.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>Scegli un sito di riconoscimento degli enzimi di limitazione appropriato (o siti) a MCS di pEUI(+) e subclone il gene di interesse nella direzione desiderata (Figura 1). Nota: Il ankyrin epitopo-etichetta EGFP o bandiera ripetere dominio 13A transgene (ANKRD13A) è stato subclonato nel sito EcoRI del vettore pEUI(+) tramite T4 DNA polimerasi in una sequenza e legatura-indipendente dalla clonazione metodo19.</li>
	...

<ol>
	<li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems.">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. 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USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP/mTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse.">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+and+mTOR:+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer.">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).</li><li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+mifepristone+(MFP).">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li><li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+mifepristone:+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies.">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li><li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes.">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li><li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. 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W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor:+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression,+and+reduced+size.">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues.">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).</li><li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter.">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li></ol>

Lo svantaggio principale dell'utilizzo di un interruttore di espressione genica binario è la necessità di trasportare contemporaneamente due plasmidi separati (driver ed effettrici) nella cella di destinazione. Questo può portare a una distribuzione iniqua dei plasmidi e causare una risposta incoerente dell'interruttore a induttori1,2,3. Altro difetto del sistema due-vector è che un minimo di due turni di selezione antibioti...

Numerose opzioni differenti del gene sono stati esplorati per la loro capacità di regolare con precisione l'espressione del transgene in colture cellulari e modelli animali, con vari gradi di successo1,2,3. Sistemi di interruttori potenziale gene devono soddisfare diversi criteri rigorosi, tra cui: direzionale precisa espressione del transgene, la risposta dose - e tempo-dipendente di induttori, trascurabile permeabilità del promotore, reversibilità del transgene attivazione attraverso la rimozione di induttore e livelli di tossicità induttore tollerabili da linee cellulari e laboratorio animali1,2,3. Parecchi induttori di piccole molecole sono stati sfruttati, tra cui tetraciclina4,5, rapamicina6,7,8, mifepristone9,10, ed ecdisone11,12,13,14. In generale, questi sistemi richiedono almeno due plasmidi contenenti due o tre unità di espressione discreti, uno o due dei quali comporre un elemento normativo (plasmide induttore) che associa un induttore di piccola molecola di acquisire attività trascrizionale; e un altro plasmide (plasmide effettrici) contenente il transgene sotto il controllo di una regione di DNA normativo che consente l'accesso dell'elemento normativo associato a induttore. Lo svantaggio principale del sistema binario è che richiede l'introduzione concomitante di due vettori (induttore ed effettrici) nella cella di destinazione. Negli esperimenti di espressione del transgene transitoria, la transfezione simultanea di due plasmidi produce inevitabilmente una popolazione delle cellule che è singolarmente transfettate con l'induttore o l'effettore, o co-trasfettate diversamente. Inoltre, il sistema binario richiede almeno due turni di selezione antibiotica per stabilire linee cellulari stabili, che è lunga e laboriosa. Così, combinando tutti i componenti necessari per l'espressione del transgene e regolamento in un singolo vettore sarebbe l'ideale per garantire l'espressione concomitante di tutti gli elementi richiesti in una singola cella e consentire la regolazione dell'espressione del transgene attraverso il trattamento con induttori di piccola molecola.
Per superare le carenze delle opzioni binarie gene, abbiamo sviluppato recentemente un interruttore gene singolare, utilizzando una Drosophila melanogaster genica basati su EcR sistema inducibile15. Ecdisone media l'espressione genica quando si lega all'eterodimero EcR/ultraspiracle (USP), che a sua volta induce il legame dell'EcR al DNA elementi regolatori3,11. Il recettore di vertebrati retinoide X (RXR), un gene ortologo di insetto USP, reclute EcR per formare un attivatore trascrizionale attivo16. Così, per l'espressione mirata di un transgene in tessuto o cellule dei vertebrati, l'EcR e RXR deve essere co-espressi contemporaneamente prima di essere stimolata da ecdisone o suoi agonisti. Poiché la funzionalità heterodimeric dello switch basati su EcR gene può essere influenzata dalla endogeno RXR livello, Paolessi et al. sostituito i domini di legame al DNA di EcR e attivazione con eterologa GAL4 DNA-binding, herpes simplex virus proteina vmw65 domini di attivazione (VP16) fuso a dominio legante-legante EcR, che poi è diventato insensibile a RXR endogeno e formate un omodimero per ottenere l'attività trascrizionale17. L'interruttore del gene basati su EcR è stata ulteriormente migliorata con la costruzione di una proteina chimerica composta da minimo VP16 attivazione dominio combinato con GvEcR, che formava un omodimero e localizzata nel citosol in assenza dell'agonista ecdisone, Teb16, 18. Legandosi agli Teb, la GvEcR ha cambiato la sua localizzazione subcellulare dal cytosol al nucleo di riconoscere un promotore ibrido composto da zebrafish E1b promotore minimo combinato con un tandem dieci ripetute sequenze di attivazione a Monte (UAS) per avviare la trascrizione del gene bersaglio16.
Per semplificare il gene precedentemente segnalato basati su EcR interruttori16,18, abbiamo combinato le caratteristiche binarie del sistema in un singolo vettore dotato di tutti gli elementi richiesti per l'espressione del transgene stimolante e quindi designato il vettore appena generato, pEUI(+) (numero di accessione GenBank: KP123436, Figura 1A)15. L'effettore risponde al GvEcR driver (driver di seguito) è costituito da dieci tandem UAS ripete accanto un promotore minimo E1b seguito da un polylinker (MCS) con sequenze di riconoscimento EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII (Figura 1B). Inoltre, per facilitare la selezione di transfected le cellule, una con puromicina promotore-driven di SV40 N-acetile-gene della transferasi (PAC) è stato collocato tra le regioni pilota ed effettrici di mantenere linee cellulari stabili (Figura 1).
Descriviamo un protocollo dettagliato per la modulazione transiente e stabile di espressione del transgene utilizzando pEUI(+). Inoltre, forniamo istruzioni dettagliate per l'utilizzo corretto di Teb come un agonista di ecdisone.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEUI(+)</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The patent license was transferred to TransLab Inc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gene-Fect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;">TLC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tebufenozide</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">S001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:71px;">SPL life science</td>
			<td style="width:119px;">11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse FLAG M2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-alpha tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">CP06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td style="width:71px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740410.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M-PER Mammalian Protein 
			Extraction Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Protease inhibitor Cock. III</td>
			<td style="width:71px;">T&#38;I</td>
			<td style="width:119px;">BPI-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

Controllo preciso dell'espressione del transgene è auspicabile in studi biologici e clinici. Tuttavia, poiché la funzionalità binaria di gene attualmente impiegati interruttori richiede il trasferimento di due unità di espressione terapeutica simultaneamente in una singola cella, l'applicazione pratica del sistema per la terapia genica è limitato. Per semplificare il sistema di espressione del transgene, abbiamo generato un interruttore gene designato come pEUI(+) che comprende un set completo di moduli di espressione del transgene in un singolo vettore. Che comprende il dominio di legame al DNA di GAL4 e modificate EcR (GvEcR), un dominio di attivazione VP16 minimal fuso con un dominio di legame al DNA di GAL4, così come un recettore di ecdisone di Drosophila (EcR), modificato l'opzione di nuova concezione singolare gene è altamente sensibile alla somministrazione di un induttore chimico in un modo dipendente dal tempo e dal dosaggio. Il vettore di pEUI(+) è uno strumento potenzialmente potente per migliorare il controllo dell'espressione del transgene in studi pre-clinici e ricerca biologica. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la modulazione di un'espressione del transgene transiente e stabile utilizzando il vettore pEUI(+) dal trattamento di tebufenozide (Teb). Inoltre, condividiamo importanti linee guida per l'uso di Teb come un induttore chimico.

L'interruttore GvEcR-based singolare gene è raffigurato in Figura 1A. Il vettore di pEUI(+) è stato ottimizzato per l'espressione del transgene regolamentato dal trattamento con Teb. La regione dell'effettore di pEUI(+) comprende un 10xUAS e un E1b promotore minimo seguita da un MCS contenenti siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII. Un segnale di poli (a) di SV40 è stato aggiunto dietro il MCS (<strong clas...

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An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione dell'espressione del transgene utilizzando pEUI(+) singolare gene interruttore di tebufenozide trattamento.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

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Genetica

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studiare l&#39;espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantificazione delle informazioni codificate dal Gene Expression livelli durante la durata della vita modulazione sotto restrizione dietetica di ampio spettro, in c. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generazione di un Gene-interrotto lo streptococco mutans Strain senza clonaggio genico

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...