Name: an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00
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저자는 소중한 의견 및 우리의 원고의 철저 한 독서에 대 한 S Y 최 (전남 대학교) 감사합니다. 이 작품은 충남 대학교의 연구 기금에 의해 지원 되었다.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>PEUI(+)의 MCS에 적절 한 제한 효소 인식 사이트 (또는 사이트)을 선택 하 고 원하는 방향으로 (그림 1) 관심사의 유전자를 subclone. 참고: EGFP 또는 플래그 피토 프 태그 ankyrin 반복 도메인 13A EcoRI 사이트에 시퀀스 및 결 찰-독립적인 방법19를 복제 T4 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 pEUI(+) 벡터의 transgene (ANKRD13A) subcloned 이었다.<...

<ol>
	<li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems.">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. 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USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP/mTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse.">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Gene+Therapy:+Translational+and+Clinical+Outlook.">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li><li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats.">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li><li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. 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이진 진 식 스위치를 사용 하 여의 주요 단점은 동시에 대상 셀에 두 개의 별도 플라스 미드 (드라이버 및 이펙터)를 제공 하는 필요. 이 플라스 미드와 inducers,12,3스위치의 일관성이 응답에서 결과의 부동 한 배급을 이어질 수 있습니다. 두 벡터 시스템의 또 다른 단점은 항생제 선택의 2 라운드의 최소 유망한 셀 라인을 식별 하...

여러 다른 유전자 스위치는 transgene 식 세포 배양 및 동물 모델, 성공1,2,3의 다양 한 각도 정확 하 게 조절 하는 능력에 대 한 탐험 되었습니다. 잠재적인 유전자 스위치 시스템 등 몇 가지 엄격한 기준을 충족 해야: transgene, inducers, 발기인의 무시할 수 시키는, 가역 transgene의 복용량 및 시간에 따른 응답의 정확한 방향 표현 유도 제거, 및 유도 독성 레벨 셀 라인을 실험실 동물1,2,3쾌활 통해 활성화. 항생물질4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10를 포함 하 여 몇 가지 작은 분자 inducers 악용 되어 그리고 ecdysone11,12,,1314. 일반적으로 이러한 시스템 2 개 또는 3 개의 개별 식 단위를 포함 하는 두 개 이상의 플라스 미드, 하나 또는 두 작성 transcriptional 활동을 얻기 위해 작은 분자 유도 규제 요소 (유도 플라스 미드) 그리고 또 다른 플라스 미드 (effector 플라스 미드) 유도 바인딩된 규제 요소에의 액세스를 허용 하는 규제 DNA 영역 통제 transgene를 포함. 이진 시스템의 주요 단점은 대상 셀에 두 개의 벡터 (유도 및 effector)의 수 반하는 도입 필요. 과도 transgene 식 실험에서 두 개의 플라스 미드의 동시 transfection 필연적으로 생산 하지는 유도 또는 이펙터, 페 단독 또는 공동 하지 똑같이 페 셀의 인구. 또한, 이진 시스템 2 라운드는 어렵고 힘 드는 안정 세포 선 확립 항생제 선택의 필요 합니다. 따라서, transgene 식에 필요한 모든 구성 요소를 결합 하 고 단일 벡터에 규제의 단일 셀의 모든 필수 요소 부수적인 표현 보장 transgene 표현의 규제에 대 한 허용을 이상적인 것 통해 작은 분자 inducers와 치료.
이진 진 스위치의 단점을 극복 하기 위해 우리 최근 개발 단 수 유전자 스위치는 초파리 melanogaster EcR 기반 유전자 유도할 수 있는 시스템15를 사용 하 여. Ecdysone 중재 유전자 발현 DNA 규제 요소3,11EcR의 바인딩 차례로 유도 EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer를 묶을 때. 척 추가 있는 retinoid X 수용 체 (RXR), 곤충, USP의 ortholog EcR 활성 transcriptional 활성 제16를 보충 한다. 따라서, 척추 세포 또는 조직에 있는 transgene의 타겟된 식 EcR과 RXR 해야 공동 표현한 동시에 ecdysone 또는 그 촉진제에 의해 자극 되 고 전에. 때문에 EcR 기반 유전자 스위치의 heterodimeric 기능 생 RXR 수준, Padidam 외에의해 영향을 받을 수 있습니다. EcR DNA 바인딩 및 활성화 도메인 분리 GAL4 DNA 바인딩, 포진 심 플렉스 바이러스 단백질 vmw65 교체 (VP16) 활성화 도메인 다음 생 RXR 응답 되었고 한 homodimer 형성 EcR의 ligand 바인딩 도메인에 융합 에 transcriptional 활동17를 얻을. EcR 기반 유전자 스위치는 homodimer 형성 ecdysone 주 작동 근, Teb16의 부재에 cytosol에는 GvEcR와 함께 최소한의 VP16 활성화 도메인의 구성 공상 단백질을 구성 하 여 더욱 향상 되었다 18. Teb에 바인딩하여는 GvEcR 변경의 subcellular 지 방화는 cytosol에서 핵 zebrafish E1b 10 탠덤와 함께 최소한의 발기인의 구성 하이브리드 발기인 반복 상류 활성화 순서 (UASs) 시작을 인식 하는 16대상 유전자의 전사
16,18전환 이전에 보고 된 EcR 기반 유전자를 단순화 하기 위해, 우리는 자극 transgene 식에 대 한 모든 필수 요소를 갖춘 다음 지정 된 단일 벡터에 결합 시스템의 바이너리 기능 새로 생성 된 벡터, pEUI(+) (은행 승인 번호: KP123436, 그림 1A)15. GvEcR 드라이버 (이 드라이버)에 응답 하는 이펙터 EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 인식 시퀀스 (그림 1B) 10 탠덤 UAS E1b 최소한의 발기인을 여러 복제 사이트 (MCS)에 의해 다음 다음 반복 구성 됩니다. 페의 선택을 촉진 하는 또한, 세포는 SV40 발기인 기반 puromycin N-아 세 틸-안정적인 셀 라인 (그림 1)를 유지 하기 위해 드라이버와 이펙터 영역 사이 전이 (PAC) 효소 유전자 배치 했다.
우리는 transgene 식 pEUI(+)를 사용 하 여의 과도 하 고 안정적인 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 ecdysone 주 작동 근으로 Teb의 성공적인 사용에 대 한 자세한 지침을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEUI(+)</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The patent license was transferred to TransLab Inc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gene-Fect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;">TLC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tebufenozide</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">S001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:71px;">SPL life science</td>
			<td style="width:119px;">11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse FLAG M2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-alpha tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">CP06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td style="width:71px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740410.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M-PER Mammalian Protein 
			Extraction Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Protease inhibitor Cock. III</td>
			<td style="width:71px;">T&#38;I</td>
			<td style="width:119px;">BPI-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

Transgene 식의 정확한 제어 생물 학적 및 임상 연구에 바람직합니다. 그러나, 현재 고용된 유전자 스위치의 바이너리 기능을 단일 셀으로 두 치료 식 단위 전송 동시에 사용 하려면, 때문에 유전자 치료에 대 한 시스템의 실용적인 응용 프로그램 제한 됩니다. Transgene 식 시스템을 단순화 하기 위해 단일 벡터의 transgene 식 모듈의 완전 한 세트를 포함 하는 pEUI(+)로 지정 하는 유전자 스위치를 생성 했습니다. 새로 개발된 된 단일 유전자 스위치 높은 GAL4 DNA 바인딩 도메인의 구성 및 수정된 EcR (GvEcR), 최소 VP16 활성화 도메인 GAL4 DNA 바인딩 도메인 (EcR), 수정 된 초파리 ecdysone 수용 체와 융합 시간 복용량에 따라 방식으로 화학 유도의 관리에 응답. PEUI(+) 벡터는 transgene 식 생물 학적 연구와 전 임상 연구에서의 제어를 향상 시키기 위한 잠재적으로 강력한 도구입니다. 여기, 우리 tebufenozide (Teb)의 치료에 의해 pEUI(+) 벡터를 사용 하는 과도 하 고 안정적인 transgene 식의 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 화학 유도로 Teb의 사용에 대 한 중요 한 지침을 공유합니다.

GvEcR 기반 단일 유전자 스위치 그림 1A에서 묘사 된다. PEUI(+) 벡터 Teb와 치료에 의해 규제 transgene 식을 위해 최적화 되었다. PEUI(+) 이펙터 지역 한 10xUAS는 E1b MCS EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 제한 효소 인식 사이트를 포함 하 여 최소한의 발기인 따라 구성 되어 있습니다. SV40 많은 신호는 MCS (그림 1B) 뒤에 추가 되었습니다. PAC...

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An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

연구

유전학

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

유전자 교란 mutans 연쇄 상 구 균 긴장 없이 유전자 복제의 생성

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...