Name: microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

كان يؤيد هذا العمل بمنحه من "برنامج بحوث شركة مونسانتو الذرة روتوورم المعرفة"، ومنحة رقم AG/1005 (إلى MDL والبطاقة الصفراء) وأموال بدء التشغيل إلى MDL من نكسو. المنح المقدمة من الذرة روتوورم برنامج لشركة مونسانتو البحوث المعرفة (AG/1005) والمؤسسة الوطنية للعلوم، ونادي أيده منح 1244772 المجلس رقم (MDL). الكتاب يعلن لا تضارب المصالح. نادي MDL تصور وتصميم التجارب؛ FC, PW و SP إجراء التجارب؛ نادي و MDL تحليل النتائج؛ ونادي والحرس الوطني و MDL كتب المخطوطة. ونحن نشكر تيريزا اوليري ووليام Klobasa غورسكي ستيفاني قدموه من مساعدة الخبراء في فحص فكر. كما نشكر الدكتور واد الفرنسية (وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية، والمختبر المركزي للبحوث الزراعية الشمالية، مؤسسة بروكينغز، والتنمية المستدامة) لشحنات بيض إنشاء مختبر المستعمرات وتوفير بروتوكولات تربية.

1-مستوى مستعمرة تربية البالغين فكر
<ol><li>الحصول على كمية كافية من فكر الكبار (500-1,000) من مختبر الشركة أو بحوث موثوق بها (انظر الجدول للمواد على سبيل مثال) ووضع في قفص3 30 سم. ملاحظة: استخدام سلالة غير ديابوسينج ينصح بشدة.</li>
	<li>إعداد فكر مصطنع يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصن?...

<ol>
	<li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm:+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest.">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li><li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm.">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).</li><li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+crop+rotation:+western+and+northern+corn+rootworms+respond+uniquely+to+a+cultural+practice.">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li><li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Susceptibility+of+Nebraska+Western+Corn+Rootworm+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+Populations+to+Selected+Insecticides.">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li><li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , (1959).</li><li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+rootworm+management+and+insecticide+resistance+management.">Corn rootworm management and insecticide resistance management.</a> Proceedings. , 45-53 (1996).</li><li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference.">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li><li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li><li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162 (2010).</li><li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+adults.">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li><li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte.">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li><li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements.">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li><li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster.">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li><li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes.">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li><li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila.">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li><li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster.">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics.">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors.">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501 (2009).</li><li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li><li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+breakage+and+repair.">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li><li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Method+for+Rearing+Diabrotica+virgifera+virgifera+(Coleoptera,+Chrysomelidae).">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li><li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression.">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li><li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions.">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li><li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+marker+for+transgenic+insects.">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li><li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selection+of+a+non-diapause+strain+of+Diabrotica+virgifera+(Coleoptera:+Chrysomelidae).">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li><li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium+embryogenesis:+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure.">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li><li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect transgenesis: methods and applications. , (2000).</li><li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor/helper+hybrids.">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li><li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11 (2007).</li><li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgene-based,+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management.">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li></ol>

على الرغم من أن microinjection لوكر مع دسرناس غرض [رني] تم الإبلاغ عن9، هذا هو البروتوكول الأول إرساء أفضل الممارسات فيما يتعلق ميكروينجيكتينج بريسيلولار وكر الأجنة، عملية حاسمة لإجراء تحول الخط و/أو جينوم كريسبر/Cas9 التحرير في هذه الأنواع. Microinjection الناجح للأجنة فكر يعتمد على عوامل ك?...

الذرة الغربية روتوورم (فكر)، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، هو الآفات هامة من الذرة1. من المثير للاهتمام، يبدو فكر التغلب على مراقبة تدابير أكثر سرعة من الآفات الزراعية الأكثر نظراً لأنها ليس فقط التكيف مع الناحية الفسيولوجية ولكن أيضا سلوكيا2،3،،من45، 6-على مدى العقد الماضي، تم التحقيق كأسلوب تحكم محتملة لفكر7،8تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني])، أداة الجينوم وظيفية قوية، وتستخدم أيضا كوسيلة لدراسة الجينات الدالة9. ومع ذلك، بينما [رني] كثيرا ما يؤديها microinjection من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA) في الأنواع الأخرى، أمر نادر في وكر [رني] على أساس حقن. وفي الواقع، هناك فقط بضعة تقارير من [رني] عبر microinjection من دسرنا في فكر9. والسبب أن فكر يمكن تحقيق مستويات عالية من الجينات ضربة قاضية عن طريق ابتلاع دسرنا7،10، حتى تسمح بدراسة تأثيرات جنينية بتغذية دسرنا إلى الأم11. بينما يجعل هذا الأسلوب فكر مادة ممتازة لتحليل الجينوم الوظيفي عن طريق [رني]، قد تباطأ التقدم المحرز في وضع منهجيات ل microinjection الجنينية في هذه الأنواع.
وعلى الرغم من القوة [رني]، وهناك عدد قليل من العيوب. على سبيل المثال، ليست كل الجينات الرد على قدم المساواة على [رني]. ويمكن جعل هذا التغير تفسير النتائج تحليل الجينوم الوظيفي أكثر صعوبة. أيضا, [رني] عابرة ولا تولد الطفرات الموروثة. من ناحية أخرى، تحول الفعل، أداة الجينوم وظيفية أخرى، يمكن أن تولد الطفرات الموروثة عن طريق إدخال عنصر قابلة ملحوظ في12،الجينوم13. وهذا يجعل التحول germline أداة ممتازة لخلق سلالات متحولة لاستخدامها في الدراسات الوراثية على المدى البعيد. يمكن أيضا استخدام التحول إنقاذ طفرة بتقديم نسخة وظيفية من الجينات إلى جينوم متحولة14. وعلاوة على ذلك، تحول الخط هو حجر الزاوية لمجموعة متنوعة من التقنيات الوراثية الجزيئية. بالإضافة إلى انقطاع و/أو إنقاذ وظيفة الجينات، يمكن استخدام تحويل germline محسن محاصرة15والجينات الملائمة16، على أساس Gal4 التعبير حمل خارج الرحم17والطفرات على نطاق الجينوم18.
في الآونة الأخيرة، تم تطوير أدوات تمكن من تحرير الجينوم المتطورة. وتشمل هذه الأدوات Nucleases المستجيب أكتيفاتورليكي النسخ (TALEN) و19،نظام كريسبر/Cas9-نوكلاس20. وميزة هذه الأدوات الجديدة أنها توفر الباحثين القدرة على حمل فاصل الحمض النووي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في ما يقرب من أي موقع داخل تقريبا أي الجينوم. بمجرد فعل، يمكن إصلاح هذه الفواصل أما نهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل، الذي يمكن أن يعرض عمليات الحذف أو الإدراج في الجينات المستهدفة، أو من خلال إصلاح الموجه من التماثل، الذي يمكن حفز حضور بناء هندسيا، استبدال الجينات كاملة أو المناطق الوراثية21،22. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق microinjection الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي و/أو البروتين في أجنة صغار جداً.
الأهم من ذلك، خلافا دسرناس المستخدمة ل [رني] والأحماض النووية والبروتينات المستخدمة للخط التحول والجينوم التحرير لا يمكن بسهولة عبر أغشية الخلية. ولذلك، يجب أن microinjection بلازميد السلطات الوطنية المعينة، مرناس، و/أو البروتينات تجري خلال مرحلة بلاستوديرم المخلوي (أي قبل الجنين الحشرات سيلولاريزيس). وهذا يجعل توقيت حقن عامل حاسم. على سبيل المثال، في melanogaster المورفولوجية، تحتاج الأجنة بالحقن خلال ساعتين بعد وضع البيض12. ولذلك، يجب أن تراعي وضع بروتوكول microinjection الجنينية ناجحة لفكر أفضل الظروف لوضع البيض الإناث، فضلا عن الأسلوب الأمثل لجمع كميات كافية من الأجنة بريسيلولار.
جهد لتحقيق مجموعة واسعة من الأدوات الوراثية الجزيئية للتأثير على فكر الأحياء يتطلب تطوير أساليب جمع وميكروينجيكتينج بريسيلولار فكر الأجنة. هنا نقدم الإرشادات التفصيلية، جنبا إلى جنب مع نصائح والخدع، لمساعدة الآخرين على استخدام التقنيات المستندة إلى التحول في فكر للبحث. بالإضافة إلى توسيع نطاق التكنولوجيات المحورة وراثيا لفكر لاستخدامها في الدراسات الجينومية الوظيفية، تمكن هذه التقنيات أيضا استراتيجيات مكافحة الآفات الجديدة القوية مثل الجينات محرك23،24 لفحصها في هذه المهمة اقتصاديا مكافحة الآفات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1155">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Qualitative Filter Paper (Black)</td>
			<td style="width:189px;">Ahlstrom</td>
			<td style="width:287px;">8613-0900</td>
			<td style="width:339px;">For egg microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 oz Containers&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Anny&#39;s Plastic Tableware</td>
			<td>ASET101</td>
			<td>Egg container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td style="width:189px;">Apex</td>
			<td style="width:287px;">66-103</td>
			<td>Substrate for WCR egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight Forceps&#160;</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td style="width:287px;">4748</td>
			<td>Handling larvae and pupae&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clorox Regular-Bleach1</td>
			<td style="width:189px;">Clorox</td>
			<td style="width:287px;">44600-30770</td>
			<td>Wash corn and dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trucker&#39;s Favorite Yellow</td>
			<td>Coor Farm Supply</td>
			<td>502</td>
			<td>Corn for feeding WCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microinjection System (Homemade)</td>
			<td style="width:189px;">NA</td>
			<td style="width:287px;">Parts &#38; instructions available upon request</td>
			<td>Controls injection pressure (0-20 psi)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Elmer&#39;s Non-toxic Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td style="width:287px;">E304</td>
			<td>Glue eggs on filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">epTIPS Microloader Tips</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:287px;">C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:189px;">Falcon</td>
			<td>25383-103</td>
			<td>Sprouting corn /150 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand&#160;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S47576C</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/9cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sparkleen</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plain Microscope Slides</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">12-549-3</td>
			<td>Holding filter paper and eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td>
			<td style="width:189px;">Frontier Agricultural Sciences&#160;</td>
			<td>F9766B</td>
			<td>WCR adult artificial diet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton Balls, Large</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Close the flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137035</td>
			<td>Collect and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>M165 FC&#160;</td>
			<td>WCR screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>DSR</td>
			<td>Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGFP filter</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>GFP2</td>
			<td>Excitation filter: 440&#8211;520 nm, emission filter: 510 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BugDorm</td>
			<td>MegaView Science</td>
			<td>DP1000_5P</td>
			<td>Cage for adult colony</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Miniature Paint Brush</td>
			<td style="width:189px;">MyArtscape</td>
			<td>MAS-102-MINI</td>
			<td>Liner 2/0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:189px;">Narishige</td>
			<td style="width:287px;">MN-151</td>
			<td>Micromanipulator and needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Microscope XY Stage</td>
			<td style="width:189px;">Olympus</td>
			<td style="width:287px;">265515</td>
			<td style="width:339px;">Microscope stage (adapted for use with stereoscope)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grade 90 Cheesecloth</td>
			<td style="width:189px;">Online Fabric Store</td>
			<td>CHEE90</td>
			<td>For egg-lay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic paraffin film&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Percival Incubator</td>
			<td style="width:189px;">Percival&#160;</td>
			<td style="width:287px;">I41VLH3C8</td>
			<td>WCR growing chamber (insect rearing incubator)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>4980-300-PK</td>
			<td>Water container for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Griffin Low Form Beakers</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>1000-600-PK</td>
			<td>For egg wash</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Cotton Rolls</td>
			<td>Richmond Dental Cotton Co.</td>
			<td>605-3599</td>
			<td>Use in water supply for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (35x10mm)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430588-500EA</td>
			<td>For diet plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:287px;">143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Topsoil</td>
			<td>The Scotts Company</td>
			<td style="width:287px;">71130758</td>
			<td>Soil for cron growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td>
			<td>United States Plastic Corporation</td>
			<td>48342</td>
			<td>Bag agar dish after microinjection/5x7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (100x15m)</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td style="width:287px;">89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128E506</td>
			<td>WCR single pair mating chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">38 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128NC888</td>
			<td>Larvae rearing box/38 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128HRD16</td>
			<td>Larvae rearing box/16 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Microinjection Scope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:287px;">WILD-M8</td>
			<td style="width:339px;">Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Adult Western Corn Rootworms</td>
			<td style="width:189px;">North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td>
			<td style="width:287px;">Non-diapase strain</td>
			<td>Request from Dr. Bryan Wade French&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td style="width:189px;">Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing

روتوورم الذرة الغربية (فكر) هو الآفات هامة من الذرة، وهو معروف لقدرته على سرعة التكيف مع استراتيجيات إدارة الآفات. على الرغم من أن تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) ثبت أن تكون أداة قوية لدراسة البيولوجيا فكر، لها حدودها. على وجه التحديد، [رني] نفسها عابرة (أي لا يؤدي إلى وراثة مندلية طويلة الأجل من النمط الظاهري المرتبطة بها)، وذلك يتطلب معرفة تسلسل الحمض النووي للجين المستهدف. الأخير يمكن أن يكون الحد إذا كان النمط الظاهري لمصلحة سيطرة الجينات المصانة سيئة، أو حتى رواية، لتحديد أهداف مفيدة سوف تكون صعبة، إذا لم يكن من المستحيل. ولذلك، ينبغي توسيع عدد الأدوات في الجينوم مربع الأدوات لوكر بوضع الأساليب التي يمكن استخدامها لخلق سلالات متحولة مستقرة وتمكين دراسات استقصائية مستقلة عن تسلسل الجينوم وكر. هنا، نحن بالتفصيل الأساليب المستخدمة في جمع وميكروينجيكت بريسيلولار فكر الأجنة مع الأحماض النووية. بينما البروتوكولات المبينة في هذا التقرير تهدف إلى خلق فكر محوره وراثيا، تحرير كريسبر/Cas9-الجينوم يمكن أيضا إجراء باستخدام نفس البروتوكولات، مع الفرق الوحيد هو تكوين الحل حقن الأجنة.

وكان أحد الاعتبارات هامة عند وضع هذا البروتوكول المرحلة التنمية الجنينية في وقت microinjection. على وجه التحديد، يتطلب تحويل germline microinjection من السلطات الوطنية المعينة من قبل سيلولاريزاتيون الجنينية. وهذا لأن السلطات الوطنية المعينة لا يمكن بسهولة عبر أغشية الخلية. محاولات لتصو?...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection "روتوورم الذرة الغربية"، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، والأجنة لتحويل الخط، أو تحرير الجينوم كريسبر/Cas9

هنا نقدم البروتوكولات للذرة الغربية بريسيلولار ميكروينجيكتينج وجمع الأجنة روتوورم غرض أداء الاختبارات الوظيفية الجينومية مثل تحويل الخط وتحرير كريسبر/Cas9-الجينوم.

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

الفيروسية النانوية ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير ورم

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

حقن مكروي الجرح الفحص و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

هيدروجيل الجسيمات النانوية حصاد البلازما أو البول للكشف عن وفرة البروتينات منخفضة

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

إنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا عن طريق الحقن برونوكلير من مجمع كريسبر/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

ترتيب القراءة طويلة جداً لتحليل الحمض النووي كله

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

كريسبر / Cas12a متعددة الجينوم التحرير من Saccharomyces سيريفيسياي وخلق الخميرة بكسل الفن

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

قياس الاسترخاء تدور شعرية الاعتماد المجال المغناطيسي من فرط الاستقطاب [1-13C] بيروفات

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

الحقن المجهري لنطاط الذرة ، Peregrinus maidis ، الأجنة لتحرير جينوم CRISPR / Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب مؤشر الانكسار أو الكشف الطيفي الكتلي لتنميط المستقلب في الأنظمة الخالية من الخلايا القائمة على Lysate

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...