Name: microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une subvention du programme de recherche connaissances Corn Rootworm Monsanto, accorde un numéro AG/1005 (pour le MDL et YC) et fonds d’amorçage au MDL de NCSU. FC a été pris en charge par des subventions du programme de recherche de Monsanto Corn Rootworm connaissances (AG/1005) et la National Science Foundation, accorder numéro MCB-1244772 (au MDL). Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés. FC et MDL conçu et créé les expériences ; FC, PW et SP effectuaient les expériences ; FC et MDL ont analysé les résultats ; et FC, NG et le MDL a écrit le manuscrit. Nous remercions Teresa O'Leary, William Klobasa et Stephanie Gorski pour leur assistance d’experts en dépistage WCR. Nous remercions également m. Wade Français (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) pour des envois d’oeufs d’établir des colonies de laboratoire et en fournissant les protocoles d’élevage.

1. colonie-niveau élevage des adultes de la région des Caraïbes
<ol><li>Obtenir une quantité suffisante d’adultes de la région des Caraïbes (500-1 000) d’un laboratoire de recherche ou entreprise fiable (voir Table des matières pour obtenir un exemple) et les placer dans une cage de 30 cm3 . Remarque : L’utilisation d’une souche non diapause est fortement recommandée.</li>
	<li>Préparer l’alimentation artificielle WCR, suivant le protocole du fabricant et versez une co...

<ol>
	<li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm:+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest.">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li><li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm.">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).</li><li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+crop+rotation:+western+and+northern+corn+rootworms+respond+uniquely+to+a+cultural+practice.">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li><li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Susceptibility+of+Nebraska+Western+Corn+Rootworm+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+Populations+to+Selected+Insecticides.">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li><li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , (1959).</li><li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+rootworm+management+and+insecticide+resistance+management.">Corn rootworm management and insecticide resistance management.</a> Proceedings. , 45-53 (1996).</li><li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference.">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li><li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li><li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162 (2010).</li><li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+adults.">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li><li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte.">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li><li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements.">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li><li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster.">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li><li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes.">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li><li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila.">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li><li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster.">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics.">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors.">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501 (2009).</li><li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li><li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+breakage+and+repair.">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li><li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Method+for+Rearing+Diabrotica+virgifera+virgifera+(Coleoptera,+Chrysomelidae).">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li><li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression.">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li><li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions.">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li><li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+marker+for+transgenic+insects.">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li><li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selection+of+a+non-diapause+strain+of+Diabrotica+virgifera+(Coleoptera:+Chrysomelidae).">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li><li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium+embryogenesis:+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure.">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li><li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect transgenesis: methods and applications. , (2000).</li><li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor/helper+hybrids.">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li><li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11 (2007).</li><li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgene-based,+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management.">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li></ol>

Même si la microinjection de WCR avec ARN doubles brins aux fins de l’ARNi a été signalé9, il s’agit du premier protocole à établir des pratiques exemplaires pour microinjecting precellular embryons WCR, un processus essentiel pour mener la transformation de la lignée germinale et/ou CRISPR/Cas9 génome de montage chez cette espèce. Microinjection réussie d’embryons WCR est tributaire de nombreux facteurs, comme c’est l’efficacité de la transformation. Ci-dessous sont quelques-...

La chrysomèle du maïs (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, est un important ravageur du maïs1. Fait intéressant, WCR semble surmonter contrôle mesure plus rapidement que les parasites agricoles plus car ils ont non seulement s’adapter physiologiquement, mais aussi sur le plan comportemental2,3,4,5, 6. au cours de la dernière décennie, l’interférence ARN (ARNi), un outil puissant de la génomique fonctionnel, a été étudiée comme une méthode de contrôle possibles pour WCR7,8et a également été utilisé comme un moyen pour étudier les gènes fonction9. Cependant, alors que l’ARNi est fréquemment effectuée par microinjection d’ARN double brin (dsRNA) chez d’autres espèces, Arni axée sur l’injection est rare dans la région des Caraïbes. En fait, il y a seulement quelques rapports d’Arni par microinjection d’ARNdb dans WCR9. La raison en est que WCR peut atteindre des hauts niveaux de gène knockdown par ingestion de dsRNA7,10, permettant même l’étude des effets embryonnaires en se nourrissant de dsRNA à la mère de11. Tandis que cette méthode rend WCR un excellent sujet pour l’analyse génomique fonctionnelle par Arni, il a ralenti le progrès sur l’élaboration de méthodologies pour la microinjection embryonnaire chez cette espèce.
Malgré la puissance de l’ARNi, il y a quelques inconvénients. Par exemple, pas de tous les gènes répondent également à Arni. Cette variabilité peut faire interpréter les résultats d’un essai de génomique fonctionnelle plus difficile. En outre, Arni est transitoire et ne génère pas de mutations héréditaires. En revanche, la transformation de cellules germinales, un autre outil génomique fonctionnelle, peut générer des mutations héréditaires par insertion d’un élément transposable marqué dans le génome12,13. Cela rend la transformation de la lignée germinale un excellent outil pour la création de souches mutantes pour utilisation dans les études génétiques à long terme. Transformation peut également être utilisée pour secourir une mutation en remettant une copie fonctionnelle du gène d’un génome mutant14. En outre, la transformation de la lignée germinale est la pierre angulaire d’une grande variété de techniques de génétique moléculaire. En plus assommant et/ou la fonction du gène de sauvetage, transformation de la lignée germinale peut être utilisée pour enhancer piégeage15, gène piégeage16, axée sur la famille Gal4 l’expression ectopique17et pangénomique mutagénèse18.
Plus récemment, des outils qui permettent le montage sophistiqué du génome ont été développés. Ces outils comprennent la Transcription Activator-Like effecteur nucléases (TALEN) et les CRISPR/Cas9-nucléase système19,20. L’avantage de ces nouveaux outils est qu’ils offrent aux chercheurs la capacité d’induire une rupture d’ADN double-brin à presque n’importe quel endroit dans presque n’importe quel génome. Une fois que l’induit, ces pauses peuvent être réparés par le biais de deux extrémités non homologue rejoindre, qui peuvent introduire des suppressions ou insertions dans le gène ciblé, ou réparation axés sur l’homologie, qui, en présence d’une construction machinée, peut catalyser la remplacement de gènes ensemble ou régions génétiques21,22. Cependant, ces méthodes nécessitent microinjection de DNA, RNA et/ou de protéine dans des embryons de très jeunes.
Ce qui est important, contrairement à l’ARN doubles brins utilisé pour Arni, les acides nucléiques et les protéines utilisées pour la lignée germinale transformation et la modification du génome ne peut pas franchir facilement les membranes cellulaires. Par conséquent, microinjection de plasmide DNAs, ARNm et/ou protéines doit avoir lieu pendant l’étape du blastoderme syncytial (c'est-à-dire avant que l’embryon insecte cellularizes). Ce qui rend le moment des injections un facteur critique. Par exemple, chez Drosophila melanogaster, embryons doivent être injectés dans les deux heures après que les oeufs poser12. Par conséquent, élaboration d’un protocole de microinjection embryonnaires réussie pour la région des Caraïbes doit tenir compte les meilleures conditions pour la pose d’ovule de la femme, ainsi que la meilleure méthode pour recueillir des quantités suffisantes d’embryons precellular.
Un effort pour apporter un large éventail d’outils génétiques moléculaires sur la biologie de la WCR exige l’élaboration de méthodes de collecte et de microinjecting precellular embryons WCR. Ici, nous fournissons des instructions détaillées, ainsi que des trucs et astuces, pour aider les autres à utiliser des techniques axées sur la transformation dans la recherche de la région des Caraïbes. En plus d’étendre des technologies transgéniques à WCR devant servir à des études de génomique fonctionnelles, ces techniques permettent aussi puissant nouvelles stratégies de contrôle de ravageurs comme gène lecteur23,24 à tester dans ce économiquement important lutte antiparasitaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1155">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Qualitative Filter Paper (Black)</td>
			<td style="width:189px;">Ahlstrom</td>
			<td style="width:287px;">8613-0900</td>
			<td style="width:339px;">For egg microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 oz Containers&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Anny&#39;s Plastic Tableware</td>
			<td>ASET101</td>
			<td>Egg container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td style="width:189px;">Apex</td>
			<td style="width:287px;">66-103</td>
			<td>Substrate for WCR egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight Forceps&#160;</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td style="width:287px;">4748</td>
			<td>Handling larvae and pupae&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clorox Regular-Bleach1</td>
			<td style="width:189px;">Clorox</td>
			<td style="width:287px;">44600-30770</td>
			<td>Wash corn and dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trucker&#39;s Favorite Yellow</td>
			<td>Coor Farm Supply</td>
			<td>502</td>
			<td>Corn for feeding WCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microinjection System (Homemade)</td>
			<td style="width:189px;">NA</td>
			<td style="width:287px;">Parts &#38; instructions available upon request</td>
			<td>Controls injection pressure (0-20 psi)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Elmer&#39;s Non-toxic Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td style="width:287px;">E304</td>
			<td>Glue eggs on filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">epTIPS Microloader Tips</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:287px;">C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:189px;">Falcon</td>
			<td>25383-103</td>
			<td>Sprouting corn /150 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand&#160;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S47576C</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/9cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sparkleen</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plain Microscope Slides</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">12-549-3</td>
			<td>Holding filter paper and eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td>
			<td style="width:189px;">Frontier Agricultural Sciences&#160;</td>
			<td>F9766B</td>
			<td>WCR adult artificial diet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton Balls, Large</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Close the flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137035</td>
			<td>Collect and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>M165 FC&#160;</td>
			<td>WCR screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>DSR</td>
			<td>Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGFP filter</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>GFP2</td>
			<td>Excitation filter: 440&#8211;520 nm, emission filter: 510 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BugDorm</td>
			<td>MegaView Science</td>
			<td>DP1000_5P</td>
			<td>Cage for adult colony</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Miniature Paint Brush</td>
			<td style="width:189px;">MyArtscape</td>
			<td>MAS-102-MINI</td>
			<td>Liner 2/0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:189px;">Narishige</td>
			<td style="width:287px;">MN-151</td>
			<td>Micromanipulator and needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Microscope XY Stage</td>
			<td style="width:189px;">Olympus</td>
			<td style="width:287px;">265515</td>
			<td style="width:339px;">Microscope stage (adapted for use with stereoscope)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grade 90 Cheesecloth</td>
			<td style="width:189px;">Online Fabric Store</td>
			<td>CHEE90</td>
			<td>For egg-lay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic paraffin film&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Percival Incubator</td>
			<td style="width:189px;">Percival&#160;</td>
			<td style="width:287px;">I41VLH3C8</td>
			<td>WCR growing chamber (insect rearing incubator)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>4980-300-PK</td>
			<td>Water container for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Griffin Low Form Beakers</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>1000-600-PK</td>
			<td>For egg wash</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Cotton Rolls</td>
			<td>Richmond Dental Cotton Co.</td>
			<td>605-3599</td>
			<td>Use in water supply for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (35x10mm)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430588-500EA</td>
			<td>For diet plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:287px;">143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Topsoil</td>
			<td>The Scotts Company</td>
			<td style="width:287px;">71130758</td>
			<td>Soil for cron growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td>
			<td>United States Plastic Corporation</td>
			<td>48342</td>
			<td>Bag agar dish after microinjection/5x7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (100x15m)</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td style="width:287px;">89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128E506</td>
			<td>WCR single pair mating chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">38 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128NC888</td>
			<td>Larvae rearing box/38 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128HRD16</td>
			<td>Larvae rearing box/16 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Microinjection Scope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:287px;">WILD-M8</td>
			<td style="width:339px;">Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Adult Western Corn Rootworms</td>
			<td style="width:189px;">North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td>
			<td style="width:287px;">Non-diapase strain</td>
			<td>Request from Dr. Bryan Wade French&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td style="width:189px;">Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing

La chrysomèle des racines du maïs (BFR) est un important ravageur du maïs et est bien connu pour sa capacité à s’adapter rapidement aux stratégies de lutte antiparasitaire. Bien que l’interférence ARN (ARNi) s’est avéré pour être un outil puissant pour étudier la biologie de la région des Caraïbes, il a ses limites. Plus précisément, Arni elle-même est transitoire (c'est-à-dire n’entraîne pas une hérédité mendélienne à long terme du phénotype associé), et il exige la connaissance de la séquence d’ADN du gène cible. Ce dernier peut être limitant si le phénotype d’intérêt est contrôlé par des gènes mal conservés, ou encore roman, parce que l’identification des cibles utiles serait difficile, voire impossible. Par conséquent, le nombre d’outils dans la boîte à outils génomique de WCR devrait être élargi par le développement de méthodes qui pourraient être utilisés pour créer des souches mutantes stables et activer les sondages indépendants de séquence du génome du BFR. Dans les présentes, nous détaillons les méthodes utilisées pour recueillir et microinject des embryons de WCR precellular avec les acides nucléiques. Alors que les protocoles décrits dans les présentes visent à la création de WCR transgénique, CRISPR/Cas9-génome réaliser un montage pourrait aussi en utilisant les mêmes protocoles, avec la seule différence étant la composition de la solution injectée dans les embryons.

Une considération importante lors de l’élaboration de ce protocole était le stade de développement embryonnaire à l’époque de microinjection. Transformation de la lignée germinale exige expressément, microinjection d’ADN avant cellularisation embryonnaire. C’est parce que l’ADN ne peut facilement traverser les membranes cellulaires. Tentatives pour visualiser les étapes du développement embryonnaire de BFR en utilisant un colorant nucléaire ont échoué parce que les ...

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Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9

Nous présentons ici des protocoles pour la collecte et microinjecting maïs precellular embryons de la chrysomèle des racines du afin d’effectuer des analyses génomiques fonctionnelles telles que la transformation de la lignée germinale et CRISPR/Cas9-génome édition.

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

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The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

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