Name: microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

यह काम मोनसेंटो कॉर्न Rootworm नॉलेज रिसर्च प्रोग्राम, ग्रांट नंबर एजी/1005 (MDL और YC) और स्टार्ट-अप फंड से MDL को NCSU से अनुदान द्वारा समर्थित था । एफसी मोनसेंटो के मकई Rootworm ज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम (एजी/1005) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, अनुदान संख्या म्क्ब-१२४४७७२ (MDL) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं घोषित करते हैं । एफसी और MDL कल्पना और प्रयोगों का डिजाइन; एफसी, पीडब्लू और एसपी ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया; एफसी और MDL परिणामों का विश्लेषण किया; और एफसी, एनजी और MDL पांडुलिपि लिखा था । हम स्क्रीनिंग WCR में उनके विशेषज्ञ सहायता के लिए टेरेसा O'Leary, विलियम Klobasa, और स्टेफ़नी Gorski धंयवाद । हम भी Dr. वेड फ्रेंच (USDA-ARS, उत्तर केंद्रीय कृषि अनुसंधान प्रयोगशाला, ब्रूकिंग्स, एसडी) अंडे के लदान के लिए लैब कालोनियों की स्थापना और पालन प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए धंयवाद ।

1. WCR वयस्कों के कॉलनी-स्तर का पालन
<ol><li>एक विश्वसनीय कंपनी या अनुसंधान प्रयोगशाला से WCR वयस्कों (५००-१,०००) की एक पर्याप्त मात्रा प्राप्त (एक उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) और एक 30 सेमी3 पिं?...

<ol>
	<li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm:+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest.">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li><li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm.">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).</li><li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+crop+rotation:+western+and+northern+corn+rootworms+respond+uniquely+to+a+cultural+practice.">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li><li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Susceptibility+of+Nebraska+Western+Corn+Rootworm+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+Populations+to+Selected+Insecticides.">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li><li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , (1959).</li><li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+rootworm+management+and+insecticide+resistance+management.">Corn rootworm management and insecticide resistance management.</a> Proceedings. , 45-53 (1996).</li><li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference.">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li><li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li><li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162 (2010).</li><li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+adults.">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li><li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte.">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li><li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements.">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li><li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster.">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li><li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes.">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li><li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila.">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li><li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster.">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics.">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors.">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501 (2009).</li><li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li><li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+breakage+and+repair.">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li><li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Method+for+Rearing+Diabrotica+virgifera+virgifera+(Coleoptera,+Chrysomelidae).">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li><li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression.">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li><li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions.">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li><li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+marker+for+transgenic+insects.">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li><li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selection+of+a+non-diapause+strain+of+Diabrotica+virgifera+(Coleoptera:+Chrysomelidae).">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li><li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium+embryogenesis:+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure.">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li><li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect transgenesis: methods and applications. , (2000).</li><li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor/helper+hybrids.">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li><li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11 (2007).</li><li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgene-based,+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management.">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li></ol>

हालांकि RNAi के प्रयोजन के लिए dsRNAs के साथ WCR के microinjection9सूचित किया गया है, यह पहला प्रोटोकॉल है microinjecting सेलुलर WCR भ्रूण, germline परिवर्तन के संचालन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं की स?...

वेस्टर्न कॉर्न rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, कॉर्न1का एक महत्वपूर्ण कीट है । दिलचस्प है, WCR नियंत्रण उपायों पर काबू पाने के लिए और अधिक तेजी से सबसे कृषि कीट से प्रतीत होता है क्योंकि वे न केवल शारीरिक रूप से अनुकूल है, लेकिन यह भी व्यवहार2,3,4,5, 6. पिछले एक दशक से अधिक, आरएनए हस्तक्षेप (RNAi), एक शक्तिशाली कार्यात्मक जीनोमिक उपकरण, WCR7,8के लिए एक संभावित नियंत्रण विधि के रूप में जांच की गई है, और यह भी जीन समारोह9अध्ययन करने के लिए एक साधन के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, जबकि RNAi अक्सर अन्य प्रजातियों में डबल-कतरा आरएनए (dsRNA) के microinjection द्वारा किया जाता है, इंजेक्शन आधारित RNAi WCR में दुर्लभ है । वास्तव में, WCR9में dsRNA के microinjection के माध्यम से RNAi की केवल कुछ रिपोर्टों रहे हैं । कारण यह है कि WCR उच्च प्राप्त कर सकते है dsRNA7,10की घूस के माध्यम से जीन पछाड़ना के स्तर, यहां तक कि मां11को खिला dsRNA द्वारा भ्रूण प्रभाव के अध्ययन की अनुमति । हालांकि इस विधि RNAi के माध्यम से कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट विषय WCR बनाता है, यह इस प्रजाति में भ्रूण microinjection के लिए के तरीके के विकास पर प्रगति धीमा है.
बिजली न होने के बावजूद RNAi में कुछ कमियां हैं । उदाहरण के लिए, नहीं सभी जीन समान रूप से RNAi को जवाब । इस परिवर्तनशीलता एक कार्यात्मक जीनोमिक्स परख के परिणाम और अधिक मुश्किल व्याख्या कर सकते हैं । इसके अलावा, RNAi क्षणिक है और heritable उत्परिवर्तनों उत्पंन नहीं करता है । दूसरी ओर, germline परिवर्तन, एक कार्यात्मक जीनोमिक उपकरण, जीनोम12,13में एक चिह्नित transposable तत्व की प्रविष्टि के माध्यम से heritable उत्परिवर्तनों उत्पंन कर सकते हैं । यह germline परिवर्तन बनाता है दीर्घकालिक आनुवंशिक अध्ययन में उपयोग के लिए उत्परिवर्ती उपभेदों बनाने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण । परिवर्तन भी एक उत्परिवर्ती जीनोम14के लिए जीन की एक कार्यात्मक प्रतिलिपि देने के द्वारा एक उत्परिवर्तन बचाव किया जा सकता है । इसके अलावा, germline परिवर्तन आणविक आनुवंशिक तकनीक की एक विस्तृत विविधता की आधारशिला है । बाहर दस्तक और/या जीन समारोह बचाव के अलावा, germline परिवर्तन बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है15फँसाने, जीन फँसाने16, Gal4-आधारित अस्थानिक अभिव्यक्ति17, और जीनोम चौड़ा mutagenesis18.
हाल ही में, उपकरण है कि परिष्कृत जीनोम संपादन सक्षम विकसित किया गया है । इन उपकरणों प्रतिलेखन उत्प्रेरक-जैसे प्रभाव Nucleases (तलेन) और CRISPR/Cas9-nuclease प्रणाली19,20शामिल हैं । इन नए उपकरणों का लाभ यह है कि वे शोधकर्ताओं को लगभग किसी भी जीनोम के भीतर लगभग किसी भी स्थान पर एक डबल-असहाय डीएनए तोड़ने के लिए प्रेरित करने की क्षमता प्रदान करते हैं । एक बार प्रेरित, इन टूटता है या तो गैर के माध्यम से मरंमत की जा सकती है मुताबिक़ अंत में शामिल होने, जो हटाने या लक्षित जीन, या समरूपता के माध्यम से मरंमत का निर्देश दिया है, जो एक इंजीनियर के निर्माण की उपस्थिति में निवेशन परिचय, उत्प्रेरित कर सकते है पूरे जीन या आनुवंशिक क्षेत्रों के प्रतिस्थापन21,22। हालांकि, इन तरीकों बहुत युवा भ्रूण में डीएनए, आरएनए और/या प्रोटीन के microinjection की आवश्यकता होती है ।
महत्वपूर्ण बात, RNAi के लिए इस्तेमाल dsRNAs के विपरीत, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन germline परिवर्तन और जीनोम संपादन के लिए इस्तेमाल किया आसानी से कोशिका झिल्ली पार नहीं कर सकते । इसलिए, प्लाज्मिड DNAs के microinjection, mRNAs, और/या प्रोटीन syncytial blastoderm चरण (यानी कीट भ्रूण cellularizes से पहले) के दौरान जगह लेना चाहिए । यह इंजेक्शन के समय एक महत्वपूर्ण कारक बनाता है । उदाहरण के लिए, Drosophila melanogasterमें, भ्रूण के दो घंटे के भीतर इंजेक्शन की आवश्यकता के बाद अंडा12रखना । इसलिए, WCR के लिए एक सफल भ्रूण microinjection प्रोटोकॉल के विकास के खाते में महिला अंडा बिछाने के लिए सबसे अच्छी शर्तों के रूप में अच्छी तरह से सेलुलर भ्रूण के पर्याप्त मात्रा में इकट्ठा करने के लिए सबसे अच्छा तरीका रखना चाहिए ।
एक के लिए आणविक आनुवंशिक उपकरण की एक विस्तृत श्रृंखला लाने के प्रयास WCR जीव विज्ञान पर भालू को इकट्ठा करने और microinjecting सेलुलर WCR भ्रूण के लिए तरीकों के विकास की आवश्यकता है । यहाँ हम विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं, सुझावों और चालों के साथ, दूसरों की मदद करने के लिए WCR अनुसंधान में रूपांतरण आधारित तकनीक का उपयोग करें. कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन में उपयोग के लिए WCR करने के लिए ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों का विस्तार करने के अलावा, इन तकनीकों को भी शक्तिशाली नई कीट नियंत्रण रणनीतियां सक्षम जीन ड्राइव23,24 के लिए इस आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण में परीक्षण किया जाएगा कीट.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1155">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Qualitative Filter Paper (Black)</td>
			<td style="width:189px;">Ahlstrom</td>
			<td style="width:287px;">8613-0900</td>
			<td style="width:339px;">For egg microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 oz Containers&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Anny&#39;s Plastic Tableware</td>
			<td>ASET101</td>
			<td>Egg container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td style="width:189px;">Apex</td>
			<td style="width:287px;">66-103</td>
			<td>Substrate for WCR egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight Forceps&#160;</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td style="width:287px;">4748</td>
			<td>Handling larvae and pupae&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clorox Regular-Bleach1</td>
			<td style="width:189px;">Clorox</td>
			<td style="width:287px;">44600-30770</td>
			<td>Wash corn and dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trucker&#39;s Favorite Yellow</td>
			<td>Coor Farm Supply</td>
			<td>502</td>
			<td>Corn for feeding WCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microinjection System (Homemade)</td>
			<td style="width:189px;">NA</td>
			<td style="width:287px;">Parts &#38; instructions available upon request</td>
			<td>Controls injection pressure (0-20 psi)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Elmer&#39;s Non-toxic Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td style="width:287px;">E304</td>
			<td>Glue eggs on filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">epTIPS Microloader Tips</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:287px;">C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:189px;">Falcon</td>
			<td>25383-103</td>
			<td>Sprouting corn /150 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand&#160;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S47576C</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/9cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sparkleen</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plain Microscope Slides</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">12-549-3</td>
			<td>Holding filter paper and eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td>
			<td style="width:189px;">Frontier Agricultural Sciences&#160;</td>
			<td>F9766B</td>
			<td>WCR adult artificial diet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton Balls, Large</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Close the flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137035</td>
			<td>Collect and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>M165 FC&#160;</td>
			<td>WCR screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>DSR</td>
			<td>Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGFP filter</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>GFP2</td>
			<td>Excitation filter: 440&#8211;520 nm, emission filter: 510 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BugDorm</td>
			<td>MegaView Science</td>
			<td>DP1000_5P</td>
			<td>Cage for adult colony</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Miniature Paint Brush</td>
			<td style="width:189px;">MyArtscape</td>
			<td>MAS-102-MINI</td>
			<td>Liner 2/0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:189px;">Narishige</td>
			<td style="width:287px;">MN-151</td>
			<td>Micromanipulator and needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Microscope XY Stage</td>
			<td style="width:189px;">Olympus</td>
			<td style="width:287px;">265515</td>
			<td style="width:339px;">Microscope stage (adapted for use with stereoscope)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grade 90 Cheesecloth</td>
			<td style="width:189px;">Online Fabric Store</td>
			<td>CHEE90</td>
			<td>For egg-lay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic paraffin film&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Percival Incubator</td>
			<td style="width:189px;">Percival&#160;</td>
			<td style="width:287px;">I41VLH3C8</td>
			<td>WCR growing chamber (insect rearing incubator)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>4980-300-PK</td>
			<td>Water container for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Griffin Low Form Beakers</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>1000-600-PK</td>
			<td>For egg wash</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Cotton Rolls</td>
			<td>Richmond Dental Cotton Co.</td>
			<td>605-3599</td>
			<td>Use in water supply for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (35x10mm)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430588-500EA</td>
			<td>For diet plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:287px;">143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Topsoil</td>
			<td>The Scotts Company</td>
			<td style="width:287px;">71130758</td>
			<td>Soil for cron growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td>
			<td>United States Plastic Corporation</td>
			<td>48342</td>
			<td>Bag agar dish after microinjection/5x7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (100x15m)</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td style="width:287px;">89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128E506</td>
			<td>WCR single pair mating chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">38 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128NC888</td>
			<td>Larvae rearing box/38 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128HRD16</td>
			<td>Larvae rearing box/16 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Microinjection Scope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:287px;">WILD-M8</td>
			<td style="width:339px;">Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Adult Western Corn Rootworms</td>
			<td style="width:189px;">North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td>
			<td style="width:287px;">Non-diapase strain</td>
			<td>Request from Dr. Bryan Wade French&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td style="width:189px;">Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing

पश्चिमी मकई rootworm (WCR) मकई का एक महत्वपूर्ण कीट है और अच्छी तरह से अपने को तेजी से कीट प्रबंधन रणनीतियों के लिए अनुकूल करने की क्षमता के लिए जाना जाता है । हालांकि आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) WCR जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हुआ है, यह अपनी सीमाएं हैं । विशेष रूप से, RNAi ही क्षणिक (यानी संबद्ध phenotype के दीर्घकालिक Mendelian विरासत में परिणाम नहीं है), और यह लक्ष्य जीन के डीएनए अनुक्रम जानने की आवश्यकता है । बाद सीमित किया जा सकता है अगर ब्याज की phenotype खराब संरक्षित, या यहां तक कि उपंयास जीन द्वारा नियंत्रित है, क्योंकि उपयोगी लक्ष्यों की पहचान चुनौतीपूर्ण होगा, अगर असंभव नहीं है । इसलिए, WCR के जीनोमिक toolbox में उपकरणों की संख्या है कि स्थिर उत्परिवर्ती उपभेदों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और WCR जीनोम के अनुक्रम स्वतंत्र सर्वेक्षण सक्षम तरीकों के विकास के द्वारा विस्तारित किया जाना चाहिए । इस के साथ साथ, हम विस्तार तरीकों को इकट्ठा करने और न्यूक्लिक एसिड के साथ WCR भ्रूण microinject के लिए इस्तेमाल किया । जबकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक WCR, CRISPR के निर्माण के उद्देश्य से कर रहे है/Cas9-जीनोम संपादन भी एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है, केवल अंतर के साथ समाधान की संरचना भ्रूण में इंजेक्ट किया जा रहा है ।

एक महत्वपूर्ण विचार जब इस प्रोटोकॉल विकासशील microinjection के समय में भ्रूण के विकास का मंच था । विशेष रूप से, germline परिवर्तन भ्रूण cellularization करने से पहले DNAs के microinjection की आवश्यकता है । इसका कारण यह है DNAs आसानी...

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Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

पश्चिमी मकई Rootworm के Microinjection, Diabrotica virgifera virgifera, Germline परिवर्तन के लिए भ्रूण, या CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन

यहां हम इकट्ठा करने और microinjecting सेलुलर पश्चिमी मकई rootworm भ्रूण के लिए इस तरह के germline परिवर्तन और CRISPR/Cas9-जीनोम संपादन के रूप में कार्यात्मक जीनोमिक परख प्रदर्शन के प्रयोजन के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान ।

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

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के लिए वायरल नैनोकणों<em&gt; Vivo में</em&gt; ट्यूमर इमेजिंग

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

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Microinjection घाव परख और<em&gt; में विवो</em&gt; एपिडर्मल का स्थानीयकरण रिस्पांस रिपोर्टर में घाव<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्लाज्मा या मूत्र के हाइड्रोजेल Nanoparticle कटाई

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

कुशल पीढ़ी और फीडर का संपादन-CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग मानव अग्नाशय कोशिकाओं से मुक्त IPSCs

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

CRISPR/Cas9 परिसर के परमाणु इंजेक्शन द्वारा आनुवंशिक रूप से इंजीनियर गोल्डन सीरियाई हंसटर का उत्पादन

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

पूरे जीनोमिक डीएनए विश्लेषण के लिए अल्ट्रा लंबे पढ़ें अनुक्रमण

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन Saccharomyces cerevisiae और खमीर पिक्सेल कला का निर्माण

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

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Hyperpolarized के स्पिन-लेटिस विश्राम चुंबकीय क्षेत्र निर्भरता को मापने [1-13C$pyruvate

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

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कैस 9 जीनोम संपादन के लिए मकई प्लांटहॉपर, पेरेग्रीनस मैडिस, भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

लिक्विड क्रोमेटोग्राफी लिसेट-आधारित सेल-फ्री सिस्टम्स में मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग के लिए अपवर्तक इंडेक्स या मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ मिलकर

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...